Файл: Методичн_ рекомендац_ї 2 частина.doc

№ пробірок Інгредієнти (в мл)	Дослід	Контролі
№ пробірок Інгредієнти (в мл)	1	2	3	4
Антитіло – гемолітична сироватка	0,5	---	0,5	---
Антиген – 3% завись еритроцитів барана	0,5	0,5	0,5	0,5
Комплемент (1:10)	0,5	0,5	---	---
Фізіологічний розчин	---	0,5	0,5	1,0

Всі пробірки ставлять в термостат на 30-45 хвилин при 37⁰ С, після чого проводять облік реакції. В даному випадку в дослідній пробірці повинен наступити гемоліз в результаті специфічної реакції між гемолітичною сироваткою і еритроцитами в присутності комплементу. В контрольних пробірках не повинно бути гемолізу, тому що в одній із них відсутній комплемент (контроль гемолітичної сироватки), в другій відсутня гемолітична сироватка (контроль комплементу), а в третій відсутні комплемент та гемолітична сироватка (контроль еритроцитів).

Питання для самоконтролю

Що означають поняття “серологічна ідентифікація збудника захворювання” та “серологічна діагностика інфекційного захворювання”?
Як класифікують серологічні реакції?
Що являють собою і як отримують стандартні діагностикуми?
Які серологічні реакції є багатокомпонентними?
Що таке система комплементу? Які шляхи її активації?
Що таке реакції лізису?
Що таке реакція імунного гемолізу? Яка мета її застосування?
Що таке реакція непрямої гемаглютинації? Яка мета її застосування?

Практичне заняття №13 Тема: «Серологічні реакції з мітками»

1.Актуальність теми:

На сучасному етапі розвитку мікробіології та імунології серед імунологічних методів діагностики інфекційних захворювань все ширше застосовуються серологічні реакції з міченими антигенами або антитілами, такі як реакція імунної флуоресценції (РІФ), імуноферментний (ІФА) та радіоімунний аналізи (РІА). Це зумовлено високою чутливістю та специфічністю вказаних реакцій, можливістю застосування їх з метою експрес-діагностики інфекційних захворювань. На практичному занятті студенти продовжують вивчення двохкомпонентних та багатокомпонентних серологічних реакцій (реакція аглютинації, реакція зв’язування комплементу), що сприяє закріпленню знань, отриманих на попередніх заняттях. Також студентам надається можливість ознайомитись з методикою постановки реакцій з мітками, самостійно здійснити оцінку поставлених РІФ та ІФА. Все це зумовлює актуальність теми заняття та спрямоване на формування позитивної мотивації її вивчення.

Конкретні цілі:

Засвоїти принципи, методику і здійснити облік реакції зв’язування комплементу (РЗК) з метою виявлення антитіл в досліджуваній сироватці.
Здійснити облік реакції аглютинації, поставленої з метою серологічної діагностики, зробити висновок.
Провести ідентифікацію мікробної культури в препараті за допомогою імунофлюоресцентного методу (демонстрація)
Ознайомитися з принципами постановки імуноферментного аналізу (ІФА) та радіоімунного аналізу (РІА). Провести облік ІФА, поставленого з метою серодіагностики.

3. Базові знання, вміння, навички, необхідні для вивчення теми (міждисциплінарна інтеграція). Дивись практичне заняття №10.

Завдання для самостійної роботи під час підготовки до заняття.
1. Перелік основних термінів, параметрів, характеристик, які повинен засвоїти студент при підготовці до заняття:

Термін	Визначення
1	2
Реакція зв’язування комплементу 1	Реакцією зв’язування комплементу – багатокомпонентна серологічна реакція, що полягає у взаємодії антигену з відповідним специфічним антитілом з утворенням специфічного комплексу антиген-антитіло та 2
	зв’язуванням комплементу. Утворений комплекс не викликає ніяких зовнішніх змін того середовища, в якому він утворився. Щоб встановити, чи відбулось зв’язування комплементу чи він лишився вільним (незв’язаним), в реакцію вводять другу систему (гемолітичну), яка в свою чергу складається з антигену (3% завис еритроцитів) та специфічної гемолітичної сироватки (взятої в потроєному титрі). За відсутності вільного активного комплементу гемолізу еритроцитів під дією специфічних гемолізинів не відбувається (реакція позитивна). У випадку невідповідності антитіла та антигену в першій системі, комплемент лишається вільним та в його присутності настає гемоліз другої системи (реакція негативна).
Моноклональні антитіла	Моноклональні антитіла (МКАТ) – антитіла, що отримують за допомогою гібридомних технологій. Належать до одного класу імуноглобулінів і реагують зі специфічним епітопом антигену, проти якого вони продуковані. В серологічних реакціях з міткою використання антитіл має цілу низку переваг у порівнянні з поліклональними антитілами, а саме: висока гомогенність, відсутність неспецифічних антитіл, простота розпізнавання і відсутність варіативності від партії до партії зразків.
Серологічні реакції з мітками	Серологічні реакції з міткою засновані на виявленні взаємодії антигену з антитілом з утворенням імунного комплексу антиген-антитіло за міткою одного з учасників реакцій, що виявляється або візуально, або за допомогою спеціальних високочутливих приладів, що дозволяють кількісно виявити мічений субстрат і, відповідно, невідомий антиген чи антитіло.
Мітка	В якості мітки застосовують або флуоресціюючий в ультрафіолетовому світлі барвник (ізоционат флюоресцеїну) при постановці реакції імунофлуоресценції (РІФ), або фермент (пероксидаза, лужна фосфатаза), що виявляється за зміною забарвлення відповідного субстрату при постановці імуноферментного аналізу (ІФА), або ізотоп, що виявляється радіометрією при постановці радіоімунного аналізу (РІА).
1	2
Реакція імунофлюоресценції	Реакція імунофлюоресценції (РІФ) заснована на властивості флюоресціюючих антитіл специфічно з’єднуватись з гомологічним антигеном і викликати їх світіння в фіолетовій і ультрафіолетовій частині спектру люмінесцентного мікроскопу. РІФ специфічна, високочутлива, використовується в основному для ідентифікації антигену і може бути здійснена в кількох варіантах. 1. Пряма РІФ – заснована на використанні імунофлуоресціюючих сироваток проти кожного досліджуваного антигену. 2. Непряма РІФ – заснована на використанні двох різних сироваток. Спочатку на першому етапі вживають немічені антитіла проти досліджуваного антигену, а на другому етапі реакції утворений комплекс антиген-антитіло обробляють флуоресціюючою сироваткою, що містить антитіла проти гамма-глобулінів того виду тварин, на яких була одержана специфічна немічена сироватка.
Імуноферментний аналіз	Імуноферментний аналіз (ІФА) заснований на використанні як мітки антитіл ферментів, здатних розкладати субстрати з утворенням забарвлених продуктів. Використовуються як прямий, так і непрямий варіанти ІФА. Суть її полягає в тому, що спочатку на якомусь твердому матеріалі сорбують антигени (або антитіла), а потім додають всі інші інгредієнти серологічної реакції. Як твердофазні носії антигену чи антитіл широко використовуються пластикові планшети, шарики, плівки, пробірки з різних синтетичних матеріалів. Адсорбовані на поверхні таких матеріалів антигени чи антитіла навіть у висушеному стані довгий час зберігають свою імунологічну специфічність і здатність вступати в серологічні реакції. Наявність і активність ферменту, зв’язаного з антитілом чи комплексом антиген-антитіло виявляють і оцінюють візуально за інтенсивністю забарвлення після інкубації з відповідним субстратом. ІФА може бути виконаний за допомогою спеціального обладнання, в якому автоматично відбувається промивка реагентів буфером (вошер) та результат реєструється за допомогою фотометра (рідер).
1	2
Радіоімунний аналіз	Радіоімунний аналіз (РІА) заснований на використанні як мітки одного з компонентів серологічної реакції радіоактивних ізотопів. Метод найбільш чутливий і дозволяє виявляти незначні кількості реагентів. Як і при постановці ІФА використовують прямий і непрямий варіанти. Для проведення РІА і реєстрації результатів необхідна спеціальна радіометрична апаратура.

Теоретичні питання до заняття:

Багатокомпонентні серологічні реакції, їх характеристика, складові компоненти.
Серологічні реакції з використанням мітки, вимоги до них.
Моноклональні антитіла, принципи отримання, їх застосування в серологічних реакціях з мітками.
Реакція зв’язування комплементу (РЗК), механізм, особливості постановки, практичне використання.
Реакція Кумбса, механізм, практичне використання.
Реакція імунофлуоресценції (РІФ), суть, варіанти постановки, практичне використання.
Радіоімунний аналіз (РІА), суть, методи, особливості постановки і обліку результатів.

Практичні завдання, які виконуються на занятті:

Провести облік реакції Відаля, що поставлена з метою визначення АТ в сироватці крові хворого проти збудників черевного тифу та паратифів А і В. Зробити висновки.
Провести облік результатів реакції зв’язування комплементу, що поставлена з метою визначення антитіл в сироватці крові хворого (демонстраційна робота). Зробити висновки.
Провести ідентифікацію культури грибів роду Candida, що забарвлені імунною сироваткою, міченою флуорохромом, в препараті за допомогою імунофлуоресцентного методу (демонстраційна робота). Зробити висновок.
Провести облік ІФА, що була поставлена з метою виявлення НВsag у сироватці крові хворих з підозрою на вірусний гепатит В (демонстраційна робота). Зробити висновки.
Вивчити зразки тест-систем для постановки ІФА з метою виялення НВsAg.

5. Зміст теми:

На практичному занятті студенти знайомляться з особливостями постановки та застосування серологічних реакцій з міченими антитілами та антигенами (ІФА, РІА, МІФ); проводять облік реакції Віддаля, що поставлена з метою визначення АТ в сироватці крові хворого проти збудників черевного тифу та паратифів А і В; проводять облік результатів реакції зв’язування комплементу, що поставлена з метою визначення антитіл в сироватці крові хворого; проводять ідентифікацію культури грибів роду Candida, що забарвлені імунною сироваткою, міченою флуорохромом, в препараті за допомогою імунофлуоресцентного методу; проводять облік ІФА, що була поставлена з метою виявлення НВsAg у сироватці крові хворих з підозрою на вірусний гепатит В; вивчають зразки тест-систем для постановки ІФА з метою виявлення НВsAg. Виконані завдання студенти записують у протокол та підписують його у викладача.

5.1.Проведення обліку реакції Відаля, що поставлена з метою визначення ат в сироватці крові хворого проти збудників черевного тифу та паратифів а і в.

При обліку реакції Відаля враховують, з яким з діагностикумів та в якому титрі відбулась реакція аглютинації. При позитивній реакції аглютинації утворюється білуватий осад на дні пробірки з більш-менш прозорою рідиною над ним. При негативній реакції рідина залишається каламутною, осад на дні пробірки відсутній. Діагностичним титром реакції Відаля у хворих, що не вакцинувались та мають типову клінічну картину, вважається 1:100, а при атипових чи стертих клінічних формах захворювання – не нижче 1:200.

5.2. Постановка реакції зв’язування комплементу (рзк) з метою виявлення антитіл в досліджуваній сироватці.

Реакція зв’язування комплементу заснована на здатності специфічного комплексу антиген+антитіло адсорбувати (зв’язувати) комплемент. Оскільки процес зв’язування комплементу не проявляється візуально, то як індикатор використовується гемолітична система (еритроцити барана + гемолітична сироватка), яка свідчить про наслідки реакції між антигеном і антитілом. Якщо антиген і антитіло відповідають один одному, то комплемент зв’язується цим комплексом і гемоліз не проходить, а якщо комплекс не утворюється, то наступає гемоліз.

РЗК відноситься до складних серологічних реакцій і для її здійснення необхідно не менше 5 інгредієнтів: антиген, антитіло і комплемент (перша система), еритроцити барана і відповідна їм гемолітична сироватка.