Файл: immunologia_N3-4_2010_block_210x297.pdf

5.Ивашкин В.Т. Неалкогольный стеатогепатит / В.Т. Ивашкин, Ю.О. Шупельникова // Болезни органов пищеварения. – 2003. - №2. – С. 41 – 45.

6.Клиническая иммунология и аллергология / под ред. Г. Лолора, Т. Фишера и Д. Адельмана: пер. с англ. – М.: Практика, 2000.

–806 с.

7.Мансуров Х.Х. Неалкогольный стеатогепатит – сравнительно новая патология в гепатологии / Х.Х. Мансуров // Проблемы гастроэнтерологии. – 2001. - №1-2. – С. 4-9

8.Москаленко В.Ф. Заболевания гепатобилиарной системы (распространенность, нерешенные проблемы) / В.Ф. Москаленко, М.В. Голубчиков: зб. наук. праць співроб. КМАПО ім. Шупіка. - 2000. - Вип. 9, Кн. 4. - С. 5-10.

9.Сергиенко В.И. Математическая статистика в клинических исследованй / В.И. Сергиенко, И.Б. Бондарева. —М.: Ботар Медицина, 2000. — 162 с.

10.Стандартизовані протоколи діагностики та лікування хвороб органів травлення: методичні рекомендації / Н.В. Харченко, Г.А. Анохіна, Н.Д. Опанасюк [та інш.] – Київ, 2005.

–56 с.

11.Степанов Ю.М. Современные взгляды на патогенез, диагностику и лечение неалкогольного стеатогепатита / Степанов Ю.М., Филиппова Ф.Ю. //Сучасна гастроентерологія. – 2008. - №3. – С. 18-24.

[Электронный ресурс]. – Режим доступа: http://www.protc.spb.ru/russian.html.

13.Унифицированные биохимические методы обследования больных: метод. рекомендации / Под. ред. Л.Л. Громашевской. – Киев: МЗ Украины, 1990. – 64 с.

14. Фадеенко Г.Д. Стеатогепатит. Биохимические маркеры и проблемы диагностики / Г.Д. Фадеенко, Н.А. Кравченко // Сучасна гастроентерологія. – 2006. – № 1. –

С. 8 – 13.

15.Філіппов Ю.О. Епідеміологічні особливості хвороб органів травлення та гастроентерологічна служба в Україні: здобутки, пробле-

ми та шляхи їх вирішення / Ю.О. Філіппов, І.Ю. Скирда // Гастроентерологія: міжвід. зб.

–Дніпропетровськ, 2005. – Вип. 36. – С. 9 - 17.

16.Ярилин А.А. Система цитокинов и принципы ее функционирования в норме и при патологии / А.А. Ярилин // Иммунология. – 1997.

–№ 5. – С. 7 – 14.

17.Adams L.A. Nonalcoholic fatty liver disease / L.A. Adams, P. Angulo, D. Lu, K. Undor – 2005.

–Vol. 172. – P. 899 – 905.

18.Angulo P. Nonalcoholic fatty liver disease / P. Angulo, K. Undor // J. Gastroenterol. Hepatol.

–2002. – Suppl. 17. – P. 187 – 191.

19.Charlton M. Nonalcoholic steatohepatitis - sometimes is more / M. Charlton // Congress of gastroenterology & Hepatology, 2001. – P. 283 – 289.

РЕЗЮМЕ

КОНЦЕНТРАЦИЯ ПРОВОСПАЛИТЕЛЬНЫХ ЦИТОКИНОВ (IL-1 , TNF ) В СЫВОРОТКЕ КРОВИ

БОЛЬНЫХ НЕАЛКОГОЛЬНЫМ СТЕАТОГЕПАТИТОМ

Елизарова Т.А., Кузнецова Л.В.

Изучена концентрация провоспалительных цитокинов (IL-1 , TNF ) в сыворотке крови больных неалкогольным стеатогепатитом (НАСГ). Установлено достоверное повышение содержания IL-1 и TNF в сыворотке крови обследованных с обострением НАСГ. Применение общепринятого лечения не обеспечивает нормализации концентрации IL-1 и TNF в сыворотке крови больных НАСГ, что свидетельствует о целесообразности использования иммуноактивных препаратов, направленных на восстановление иммунного гомеостаза.

Ключевые слова: неалкогольный стеатогепатит, провоспалительные цитокины (IL-1 и TNF ), патогенез.

SUMMARY

CONCENTRATION OF PROINFLAMMATORY CYTOKINES (IL-1 , TNF ) AT SERUM OF THE

PATIENTS WITH NONALCOHOLIC STEATOHEPATITIS

Elisarova T.O., Kuznetsova L.V.

The concentration of proinflammatory cytokines (IL-1 , TNF ) at serum of teenagers with nonalcoholic steatohepatitis (NASH) was studied. It was set increase of IL-1 and TNF level at serum of patients with NASH. It was set that application of generally accepted therapy don’t provided normalization of concentration of IL-1 , TNF at serum of patients with NASH that needed to using of immunoactive preparation to normalization of immune homeostasis.

Key words: nonalcoholic steatohepatitis, proinflammatory cytokines (IL-1 , TNF ), pathogenesis.

В останній час все більшого поширення набувають неізотопні колориметричні методи оцінки цитотоксичної дії на клітини, такі як МТТколориметричний тест [9,13] та тест з нейтральним червоним [3], які є не менш чутливими, ніж класичні ізотопні методи [8].

Колориметричний метод із застосуванням МТТ (3-[4,5-диметилтіазол-2-іл]-2б5- дифенилтетразоліум бромід) вперше був запропонований Mossmann T. у 1983 р. [12] для визначення проліферації та життєздатності клітин. Метод засновано на тому, що мітохондріальні ферменти у життєздатних клітинах, в яких збережена мітохондріальна активність, перетворюють доданий в культуру клітин субстрат – МТТ-тетразолієву сіль жовтого кольору у кристалічний МТТ-формазан пурпурного кольору. Пізніше МТТ-метод знайшов своє застосування в експерименті in vitro для оцінки цитотоксичної активності макрофагів, цитотоксичних лімфоцитів та ЛАК-клітин [1,7,10,11], а також клітинної та лікарської цитотоксичності [5,6].

Метою нашої роботи була адаптація колориметричного МТТ-методу для дослідження специфічної алоцитотоксичної активності імунокомпетентних клітин експериментальних тварин-реципієнтів в алогенній системі в динаміці розвитку імунної відповіді на різні алоантигени донорів.

МАТЕРІАЛ І МЕТОДИ

За прототип нами було взято відомий протокол Шпакової А.П. та ін. (2000) [9], в якому розроблено МТТ-колориметричний метод визначення цитотоксичної активності природних кілерних клітин. Нам необхідно було адаптувати метод для визначення цитотоксичної активності імунокомпетентних клітин тварин-реципієнтів стосовно алогенних імунокомпетентних клітин тварин-донорів. Для досягнення мети нашого дослідження необхідно було вирішити наступні завдання: відпрацювати робочі концентрації клітин, що використовуються для постановки реакції в алогенній системі; знайти ефективне співвідношення ефектор-мішень, яке дозволить прослідкувати зміну цитотоксичної активності імунокомпетентних клітин у інтактних та дослідних тварин.

В якості клітин-ефекторів використовували лімфоцити лімфовузлів мишей-реципієнтів С57BL/6 експериментальних груп. В якості клітин-мішеней використовували лімфоцити лімфовузлів мишей-донорів СВА. Для цього виділяли лімфоцити лімфовузлів (n=6 від кожної тварини) мишей, підраховували кількість клітин у камері Горяєва з 3% розчином оцтової кислоти та кількість життєздатних клітин з 0,2% розчином трипанового синього. Життєздатність клітин у суспензіях складала (92,3+4,6)%.

Дослідження залежності рівня продукції МТТ-формазана від кількості клітин у лунці. На першому етапі готували суспензії лімфоцитів лімфовузлів (n=12) мишей С57BL/6, СВА та нелінійних мишей у концентраціях 103, 104, 105, 106, 107, 108 клітин /мл та інкубували в середовищі RPMI + 10% ETC 16 год при 370С або 16 год при 40С. Для цього суспензії у вказаних концентраціях у кількості 100 мкл вносили у комірки планшетів та додавали 100 мкл середовища RPMI + 10% ETC. Після закінчення інкубації в комірки планшету додавали 20 мкл розчину реактиву МТТ (0,5 мг/мл) та інкубували ще 3 год при вищевказаних умовах. Після цього клітини осаджували центрифугуванням при 1000 об/хв протягом 15 хв, відбирали супернатант, додавали 150 мкл димексиду та інкубували 30 хв при 200С для розчинення гранул формазану. Інтенсивність сигналу в комірках реєстрували фотометрично при 570 нм за допомгою імуноферментного аналізатора Ц-01С.

Знаходження ефективного співвідношення ефектор-мішень для дослідження цитотоксичної активності імунокомпетентних клітин МТТколориметричним методом. На другому етапі відпрацьовували варіанти постановки МТТ-тесту з використанням різних співвідношень ефектормішень: 20:1, 10:1, 5:1. В якості клітин-мішеней використовували лімфоцити лімфовузлів інтактних мишей СВА (у концентрації 0,25х107), в якості клітин-ефекторів використовували лімфоцити лімфовузлів інтактних мишей С57BL/6 (у концентраціях 1,25х107, 2,50х107, 5,00х107 відповідно). Для постановки використовували протокол [9]. Цитотоксичність виражали цитотоксичним індексом (ЦІ) у відсотках:

при кількості клітин у лунці від 102 до 106 (або 103 до 107 клітин /мл суспензії), досягаючи лінійного зростання при кількості клітин у лунці від 106 до 107 (або 107 до 108 клітин /мл суспензії).

При цьому не виявлено міжлінійних відмінностей між клітинами мишей різних ліній, мала значення лише концентрація клітин у комірці. Таким чином, для отримання ефективного співвідношення ефектор-мішень і досягнення значущих і достовірних відмінностей між рівнем сигналу від заданих концентрацій клітин в подальшому використовували концентрації клітин в діапазоні від 107 до 108 клітин /мл суспензії.

Крім того, вказана закономірність спостерігалась при обох режимах інкубації: 16 год при

370С та 16 год при 40С; величина сигналу при другому режимі була в середньому достовірно вища, ніж при першому.

ІІ. Знаходження ефективного співвідно-

шення ефектор-мішень для дослідження цитотоксичної активності імунокомпетентних клітин МТТ-колориметричним методом.

На другому етапі відпрацьовували варіанти постановки МТТ-тесту з використанням різних співвідношень ефектор-мішень: 20:1, 10:1, 5:1. Результати представлені в табл.1. Як видно, значення цитотоксичного індексу інтактних тварин в алогенній системі достовірно відрізнялись при збільшенні співвідношення ефектор-мішень з 5:1 до 10:1 та 20:1, зростаючи в середньому від 35% (5:1) до 78% (10:1) та 89% (20:1).

Таблиця 1.

Наші дані не протирічать даним [9], які показали наростання значення ЦІ при збільшенні співвідношення ефектор-мішень. Оскільки нашим завданням було знайти ефективне співвідношення ефектор-мішень, яке дозволить прослідкувати зміну цитотоксичної активності іму-

нокомпетентних клітин у інтактних та дослідних тварин, в подальшому використовували співвідношення ефектор-мішень 5:1, оскільки значення ЦІ, отримані при цьому співвідношенні, достовірно відрізнялись від тих, що були отримані при інших співвідношеннях.

Отже, застосування відпрацьованих нами концентрацій клітин та співвідношення ефектормішень 5:1 дозволило виявити відмінності цитотоксичної активності імунокомпетентних клітин інтактних та дослідних тварин та простежити динаміку алоімунної відповіді після внутрішньо-

мозкової трансплантації клітин різних типів. Крім того, розроблені умови постановки методики дозволяють відстежувати як динаміку розвитку клітинної імунної відповіді на алоантигени, так і її інтенсивність в залежності від ступеня імуногенності алоантигенів.