Файл: immunologia_N3-4_2010_block_210x297.pdf

ВИСНОВКИ

1.Досліджено залежність рівня продукції МТТформазана від кількості клітин у лунці і встановлено, що використання концентрацій клітин в діапазоні від 107 до 108 клітин /мл суспензії (106 – 107 клітин на комірку) дозволяє досягнути пропорційної залежності між рівнем інтенсивності сигналу та кількості клітин у комірці планшету.

2.Значення цитотоксичного індексу лімфоцитів лімфовузлів інтактних тварин в алогенній системі залежить від кількісного співвідношення ефекторних клітин та клітин-мішеней; ефективним є співвідношення 5:1; цитотоксична активність інтактних мишей в алогенній системі при цьому співвідношенні становила (32,08+8,38)%.

3.Застосування відпрацьованих нами концентрацій клітин та співвідношення ефектормішень 5:1 дозволило простежити динаміку імунної відповіді на алоантигени після внутрішньомозкової трансплантації клітин різних типів. Клітинна відповідь на алоантигени реципієнтів мала місце при внутрішньомозковому введенні як нейроклітин та клітин лімфовузлів дорослих тварин, так і фетальних нейроклітин (Е13-15) донорів. Найвищі значення цитотоксичної активності лімфоцитів реципієнтів реєструються на 6-12-у після внутрішньомозкового введення клітин.

4.Розроблені умови постановки реакції клітинної цитотоксичності з МТТ-реактивом дозволяють рекомендувати її до використання не лише для визначення активності природних кіллерів, а також і специфічної імунної відповіді на алота онкоантигени.

ЛІТЕРАТУРА

1.Борисевич Н.В., Шман Т.В., Алейникова О.В.

Структура первых рецидивов острого лимфобластного лейкоза у детей и оценка результатов их лечения с учетом МТТ-теста // Вопросы гематологии, онкологии и иммунопатологии в педиатрии.-2004.- Т.3, № 1.- С.95-98.

2. Изучение вариабельности интенсивности метаболизма МТТ в культуре клеток при оценке пролиферации и гибели клеток с помощью МТТ-теста / А.С.Макаренков, С.М.Терехов, Е.А.Калашникова, Т. Д. Смирнова // Цитология. — 2003, №9. — С.899.

3.Кузовкова Н.А. Оценка активности естественных киллеров колориметрическим методом // Иммунология.-1991.-№4. - С.59-61.

4.Лісяний М.І., Любич Л.Д. Особливості розвитку імунної відповіді на внутрішньо мозкове введення алогенних фетальних нейроклітин в експерименті // Імунологія та алергологія.- 2009.-№4.- С.99-109.

5.Оптимизация критических параметров МТТ-теста для оценки клеточной и лекарственной цитотоксичности / В.С.Черепович, Е.В.Волочник, Е.В.Антоненко, Е.С.Лоткова, Т.В.Романовская, В.В.Гринев // БМЖ.- 2006.-2(16).

6.ПашковаВ.С.,ФилипповаЛ.А.,ЛавреновА.Л.

Способ определения индивидуальной химиочувствительности опухоли у больных in vitro // Патент Российской Федерации на изобретение RU2094802. 1997.10.27.

7.Прогностическое значение определения чувствительности бластных клеток детей с острым лимфобластным лейкозом к химиопрепаратам in vitro / С.С.Кузнецова, А.Н.Иншаков, С.А.Маякова, Ю.В.Шишкин, А.Ю.Барышников // Российский биотерапевтический журнал.- 2004.-Т.3, №1.- С.61-67.

8.Тейлор П., Томас Д., Миллз К. Культивирование линий и клонов Т-клеток in vitro //В.кн. «Лимфоциты. Методы» П/р Дж.Клауса.-М.: «Мир».-1990.- С.208-229.

9.Шпакова А.П., Павлова К.С., Булычева Т.И.

МТТ-колориметрический метод определения цитотоксической активности естественных киллерных клеток // Клин.лаб. диагностика.-2000.-№ 2.-С.20-23.

10.A tetrazolium-based colorimetric MTT assay to quantitate human monocyte mediated cytotoxicity against leukemic cells from cell lines and patients with acute myeloid leukemia / A.A.Van de Loosdrecht, R.H.J.Beelenb, G.I.Ossenkoppele, M.G.Broekhoven, M.M.Langenhuijsen // J.Immunol.Meth. - 1994. - Vol. 174 (1-2).- P. 311-320.

11.Cell mediated cytotoxicity against U937 cells by human monocytes and macrophages in a modified colorimetric MTT assay / A.A.Van de Loosdrecht, E.Nennie, G.I.Ossenkoppele, R.H.Beelen, M.M.Langenhuijsen // J.Immunol. Meth.-1991.-Vol.141.-P.15-22.

12.MosmannT.Rapidcolorimetricassayforcellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity assays // J.Immunol.Methods.- 1983.-Vol.65(1-2).-P.55-63.

13.Qing-xia Niu, Cheng-yan Zhao, Zhi-an Jing. An evaluation of the colorimetric assays based on enzymatic reactions used in the measurement of human natural cytotoxicity // J.Immunil. Meth.-2001.-Vol.251(1-2).-P.11-19.

РЕЗЮМЕ

МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЯ ЦИТОТОКСИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ ИММУНОКОМПЕТЕНТНЫХ КЛЕТОК МТТ-КОЛОРИМЕТРИЧЕСКИМ МЕТОДОМ

Н.И.Лисяный, Л.Д.Любич

ГУ «Институт нейрохирургии им.акад.А.П.Ромоданова АМН Украины», отдел нейроиммунологии, Киев, Украина

Целью работы была адаптация колориметрического МТТ-метода для исследования специфической аллоцитотоксической активности иммунокомпетентных клеток животных экспериментальных групп в аллогенной системе при моделировании реакций трансплантационного иммунитета. Применение концентраций клеток в диапазоне от 107 до 108 клеток/мл и соотношения эффектор-мишень 5:1 позволило выявить отличия цитотоксической активности иммунокомпетентных клеток интактных и опытных животных и проследить динамику иммунного ответа на аллоантигены после внутримозговой трансплантации клеток разных типов.

SUMMARY

MTS COLORIMETRIC ASSAY FOR STUDY OF CYTOTOXIC IMMUNOCOMPETENT CELLS ACTIVITY

N.I.Lisyany, L.D.Lyubych

Acad.A.P.Romodanov Institute of Neurosurgery Acad.Med.Sci. of Ukraine, Neuroimmunology department, Kyiv, Ukraine

The purpose of paper was adaptation of colorimetric MTS assay for the study of specific allocytotoxic activity of immunocompetentcellsfromexperimentalanimalswithmodeled allogeneic immunity reactions following transplantation. The application of cell concentration from 107 till 108 cells/ml and effector-target ratio 5:1 allowed to detect distinction between allocytotoxic activity of immunocompetent cells from intact and experimental animals and to trace the dynamics of immune response to alloantigens after intracerebral transplantation of different cell types.

Вступ. Судинні захворювання головного мозку завдяки високій розповсюдженості та значному рівню інвалідизації являють собою одну із важливих медико – соціальних проблем сьогодення, серед цереброваскулярних захворювань значну частину складають гострі порушення мозкового кровообігу (ГПМК), які щорічно вражають від 5,6 до 7,0 млн. людей та забирають життя у 4,6 млн. чоловік на планеті. Аналогічна ситуація і на України, де щорічно фіксується понад 150 тисяч інсультів, а смертність від цереброваскулярної патології займає друге місце в структурі загальної смертності населення нашої країни [1]. Дослідженнями останнього часу встановлено інтегральний зв’язок між морфофункціональними елементами нервової, ендокринної та імунної систем, про що свідчить наявність спільних рецепторів до лімфокінів, нейропептидів та нейрогормонів на плазматичних мембранах клітин нервової та імунної систем організму. Доведено, що нейроімунні зв’язки при різних захворюваннях нервової системи можуть змінюватись, і, тим самим, призводити до порушень функції імунної системи, розвитку аутоімунних реакцій до антигенів мозку та впливати опосередковано на виникнення ГПМК, його перебіг та наслідки. Не дивлячись на значні досягнення у вивченні патологічних процесів, що призводять до порушень функції імунної системи при виникненні ГПМК, його перебігу та ускладнень, багато питань залишаються невивченими, а значна їх частина потребує більш детального дослідження, на сучасному методичному рівні. Зокрема це стосується вивчення особливостей запально-нейроімунних порушень у хворих після перенесеного ГПМК на різних етапах реабілітації, залежно як від ступеня неврологічного дефіциту, так і глибини змін в імунній системі, локалізації ішемічного інсульту, розробки показань до імунокорекції та її обґрунтування і вибору.

Мета роботи – визначити стан імунного та цитокінового статусу у хворих після перенесеного ГПМК за ішемічним типом залежно від статусу неврологічних порушень в періоді ранньої реабілітації.

МАТЕРІАЛ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ

Обстежено 50 хворих після перенесеного ГПМК віком від 40 до 65 років та 25 здорових осіб, співставлюваних за віком та статтю. Комплексне

дослідження включало клініко – анамнестичне обстеження, КТ головного мозку або МРТ, що дозволило виявити ознаки ішемічного ураження різної локалізації та розміру. Ступінь порушень неврологічного статусу оцінювали за шкалою Бартеля та чотирьохбальної оцінки в день поступлення, та кожні 10 днів перебування в стаціонарі. Виражений ступінь порушень (F4) за шкалою чотирьохбальної оцінки мали 16 хворих (32%), помірний (F3) – 10 хворих (20%), легкий (F2) – 20 хворих (40%), 4 хворих (8%) порушень неврологічного статусу не мали (F1). Вміст основних та активованих популяцій та субпопуляцій лімфоцитів вивчали непрямим імунофлюоресцентним методом за допомогою моноклональних антитіл на аналізаторі Facscan (Beckton Dikinson) [2]. Сироваткову концентрацію інтерлейкіну-1 (ІЛ- 1 ), інтерлейкіну-6 (ІЛ-6), інтерлейкіну-4 (ІЛ-4) та фактору некрозу пухлин- (ФНП- ), вивчали імуноферментним методом за методикою, розробленою фірмою виробником, функціональну активність Т-лімфоцитів – за допомогою РБТЛ з ФГА [3], В-лімфоцитів – за продукцією сироваткових Ig G, Ig A, Ig M [4]. Концентрацію ЦІК визначали методом преципітації в розчині ПЕГ-6000 з виділенням фракцій ЦІК за молекулярною масою [5]. Вивчення фагоцитарної активності нейтрофілів оцінювали за ступенем поглинання часток латексу діаметром 1,2 мкм із обчисленням фагоцитарного індексу Гамбурга та фагоцитарного числа Райта [2]. Для оцінки обґрунтованості та достовірності отриманих результатів проводилась статистична обробка даних з використанням комп’ютерної програми Microsoft Excel.

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ

Проведені дослідження стану клінічного та гуморального імунітету та цитокінового статусу у хворих із наслідками ішемічного інсульту виявили зміни у складі та функціональній активності популяцій СD3+, СD4+, СD8+ СD16+ та СD19+ лімфоцитів, активаційних молекул СD25+, СD54+ та СD95+, фагоцитарній активності нейтрофілів, рівні Ig G, Ig А та Ig M і ЦІК різної молекулярної маси, прозапальних (ФНП- , ІЛ-1 та ІЛ-6) та протизапальних (ІЛ-4) цитокінів залежно від ступеня неврологічних порушень.

В результаті проведених досліджень встановлено, що, незалежно від ступеня неврологічних порушень, кількість лейкоцитів та лімфоцитів у