Файл: immunologia_N3-4_2010_block_210x297.pdf

Дослідження цитотоксичної активності алоантитіл МТТ-колориметричним методом. В якості клітин-мішеней використовували лімфоцити лімфовузлів мишей-донорів СВА, які інкубували в присутності сироваток мишей-реципієнтів С57BL/6 експериментальних груп з додаванням комплементу морської свинки (1:10) 24 год при 370С. Використовували розведення сироваток 1:10. Завершення реакції та реєстрацію результатів проводили за протоколом,описаним раніше [3]. Цитотоксичність виражали ЦІ у відсотках:

Де ОГс+м - значення оптичної густини в лунках сироватка+мішені; ОГм - значення оптичної густини в лунках з мішенями.

Дослідження гуморальних аутоімунних реакцій до нейроспецифічних білків (НСБ).

Рівень аутоантитіл до НСБ (ОБМ, S-100, NSE) в сироватках тварин експериментальних груп визначали твердофазним імуноферментним методом із використанням для тест-систем самостійно отриманих і стандартизованих НСБ [6].

Математична обробка отриманих результатів проводилася з використанням пакету статистичних програм «Microsoft Office Excel 2003».

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ

Встановлено, що на 6-у добу після внутрішньоочеревинного введення клітин в обох досліджуваних групах достовірно зростала цитотоксична активність лімфоцитів лімфовузлів мишей-реципієнтів С57BL/6 у МТТ-тесті стосовно лімфоцитів лімфовузлів мишейдонорів СВА (р<0,0007 у порівнянні з контролем) (рис.1,А). В наступні терміни ці показники знижувались з 12-ї по 37-у добу (р<0,004 у порівнянні з контролем). При цьому в групі тварин, яким було введено лімфоцити дорослих мишей-донорів, цитотоксична активність лімфоцитів в усі терміни спостереження була вища, ніж у тварин з введенням фетальних НКП (Е13-15): у групі тварин із внутрішньоочеревинним введенням фетальних НКП (Е13-15) цитотоксична активність лімфоцитів лімфовузлів достовірно відрізнялась від аналогічного показника тварин з введенням лімфоцитів лімфовузлів на 6-у (р<0,007), 18-у (р<0,0001) та 37-у добу (р<0,016). Призначення сандімуну дозволило знизити показники алоцитотоксичної активності у групах тварин із введенням лімфоцитів на 12-18-у добу (р<0,03 та р<0,014 відповідно) після імунізації.

цитотоксичних клітинних реакцій зареєстровано у тварин, яким було введено лімфоцити дорослих мишей-донорів, дещо нижчим цей показник був у тварин з введенням фетальних НКП (Е13-15).

На наш погляд, розвиток клітинних алоцитотоксичних реакцій імунітету на 6-у добу після внутрішньоочеревинного введення алогенних фетальних НКП (Е13-15) свідчить про наявність антигенів комплексу гістосумісності на фетальних НК, що необхідно враховувати при клінічній нейротрансплантації. При цьому рівень експресії антигенів гістосумісності фетальними НК є, вочевидь, нижчим, ніж на імунокомпетентних клітинах (лімфоцитах лімфовузлів), проте достатнім для генерації алоцитотоксичної клітинної відповіді. Не дивлячись на те, що в науковій літературі не існує усталеної думки щодо експресії антигенів МНС I i II класів нейральними СК, значна кількість дослідників виявили експресію антигенів гістосумісності І та ІІ класу НСК та НПК людини [9,14,17-19]. Ці дані узгоджуються з отриманими нами раніше результатами, де показана можливість експресії антигенів гістосумісності на рівні мРНК та протеїновому рівні нейроклітинами людини різного терміну гестації [4,5,7]. Як відомо, мембранні антигени МНС I класу забезпечують взаємодію антигенпрезентуючих клітин з CD8+ Т-лімфоцитами, а антигени МНС IІ класу – з СD4+ Т-лімфоцитами; отже, наявність на НСК та НПК антигенів гістосумісності І та ІІ класу забезпечує розпізнавання алогенних детермінант як природними кіллерами та цитотоксичними лімфоцитами, так і Т-лімфоцитами- хелперами. При цьому, крім представлення антигену за допомогою антигенпрезентуючих клітин лімфатичних вузлів реципієнта, не можна виключати прямого представлення антигену МНС ІІекспресуючими НКП фетального мозку, що вводяться реципієнту.

З 12-ї доби реєструвалось зниження алоцитотоксичної клітинної відповіді реципієнтів на алоантигени мишей-донорів. Можна припустити, що на цю ланку імунної відповіді введені НКП (Е13-15) чинили імуносупресивний вплив, що фіксувався вже на 12-у добу після введення клітин, можливість якого підтверджена даними інших дослідників [14-16]. Зокрема, у роботі [15] показано за допомогою магнітно-резонансної візуалізації, що при внутрішньовенному введенні НПК останні не потрапляли в ЦНС, а транзиторно виявлялись у лімфовузлах та селезінці, де вони пригнічували активацію та проліферацію Т-клітин і значно знижували їх імуногенність. На нашу думку, схожий механізм може реалізуватись при внутрішньоочеревинному введенні фетальних НКП.

Так, Fainstein N. et al. (2008) [16] встановили, що НПК пригнічували in vitro індукцію маркерів активації Т-клітин (IL-2R- , PD-1, CTLA) та про-

ліферацію Т-клітин у відповідь на стимули, опосередковані Т-клітинним рецептором, а також пригнічували проведення сигналу прозапальних цитокінів в імуноцитах.

Цікавим у цьому плані є дослідження Akesson E. еt al.(2009) [14]. Автори досліджували у порівнянні алогенну імунну відповідь на НСК, астроцити та нейрони. За їх даними, астроцити експресували молекули як МНС І класу, так і МНС ІІ класу, на тому ж рівні, що і НСК, тоді як нейрони – тільки МНС І молекули. НСК та астроцити, але не нейрони, виявляли супресивний ефект на алогенну імунну відповідь.

Особливості динаміки клітинних алоімунних реакцій після введення фетальних НК можуть пояснюватись кількома механізмами:

–безпосередньою взаємодією НСК чи НКП з Т-лімфоцитами, яка призводить до клональної анергії чи апоптозу останніх через відсутність костимулюючого сигналу від костимуляторних молекул;

–секрецією НСК біологічно активних сполук із імуносупресивною дією;

–супресивною дією CD4+CD25+Foxp3+ регуляторних Т-лімфоцитів, здатних пригнічувати алоспецифічні Т-лімфоцити, що розглядаються як засіб індукції імунологічної толерантності до алотрансплантатів для попередження гострого та хронічного відторгнення трансплантатів [9].

Унаших дослідах при внутрішньоочеревинному введенні клітин розвивались гуморальні алоцитотоксичні імунні реакції, досягаючи максимуму на 12-18-у добу і знижуючись з 18-ї по 37-у добу дослідження. Через місяць після внутрішньоочеревинного введення різних типів клітин реєструвався залишковий рівень алоцитотоксичних антитіл у титрі 1:10, який вдалося знизити призначенням сандімуну.

Поряд з алоцитотоксичною гуморальною відповіддю, нами досліджено також нейроаутоімунні гуморальні реакції. Слід вказати, що на відміну від досить значного рівня цитотоксичних алоспецифічних антитіл, ми не зафіксували значущого рівня тканинноспецифічних аутоантитіл до НСБ у експериментальних тварин при внутрішньоочеревинному введенні клітин.

Як і можна було очікувати, у тварин з введенням лімфоцитів дорослих донорів рівні аутоантитіл до всіх досліджених НСБ не відрізнялись від контролю у всі терміни спостереження.

Угрупі тварин із введенням фетальних НКП рівень аутоантитіл до ОБМ зростав на 18-у добу,

вподальшому незначно знижуючись до 37-ї доби спостереження. Динаміка рівнів аутоантитіл до S-100 та NSE була іншою: рівень аутоантитіл до S-100 на 6-у добу був нижчим за контроль, а в подальші терміни підвищувався, зростаючи вище норми на 37-у добу; рівень аутоантитіл до

NSE був нижчим за контроль на 12-18-у добу, в подальшому підвищуючись до контрольних значень до 37-ї доби спостереження.

За даними літератури, вміст НСБ збільшується в процесі дозрівання структур мозку у ссавців і корелює з функціональним розвитком нервової тканини [8]. Наприклад, S-100 в мозку ембріонів людини з’являється у спинному, довгастому, середньому мозку, мості та мозочку

увіці 10-15 тижнів пренатального онтогенезу, а в корі переднього мозку ідентифікується тільки

увіці 30 тижнів і його вміст корелює з появою електричної активності цієї зони [8]. Вважають, що період експоненціального зростання НСБ в онтогенезі співпадає із закінченням проліферації, диференціювання та початком функціонування клітин [8]. Виходячи з вищевикладеного, НКП з фетального мозку миші 13-15 доби гестації експресують досліджувані НСБ на рівні, достатньому для індукції гуморальної аутоімунної відповіді.

Як відомо, в нормальних умовах у інтактних організмів НСБ присутні у сироватці крові у низьких концентраціях внаслідок природної загибелі нейроклітин [12], а також існує базовий низький рівень природних аутоантитіл до власних НСБ; в нормі підтримується динамічна рівновага між рівнями НСБ та відповідними специфічними аутоантитілами. Можна припустити, що при внутрішньоочеревинному введенні фетальних НКП частина клітин потрапляє у лімфовузли та селезінку, де вони контактують з антигенпрезентуючими клітинами та індукують специфічні антитілопродукуючі клітини; тоді як інша частина клітин гине, вивільняючи НСБ, які зв’язуються циркулюючими природними аутоантитілами, і таким чином відтерміновують наростання титрів нейроаутоантитіл, чим пояснюється розвиток нейроаутоімунної гуморальної відповіді у більш пізній термін (18-37-а доба), ніж алоцитотоксичної (6-18-а доба), а також зменшення нижче контролю рівнів аутоантитіл до S-100 (6-а доба) та NSE (12-18-а доба) .

Таким чином, після внутрішньоочеревинного введення клітин нами зафіксовано підвищений рівень антитіл до ОБМ (18-а доба) та S-100 (37-у доба) у тварин з введенням фетальних НКП (Е13-15), що свідчить про потенціальну можливість розвитку нейроспецифічних аутоімунних реакцій після внутрішньоочеревинного введення попередників НК. Очевидно, контакт фетальних НКП (Е13-15) з антигенпрезентуючими клітинами реципієнта веде до індукції специфічних антитілопродукуючих клітин.

Застосування імуносупресії сандімуном дозволило знизити рівень анти-ОБМ-антитіл на 37-у добу до норми, та дещо зменшити рівень анти-S-100-антитіл у цей термін. Як відомо, циклоспорин А (Сандімун для парентерального

введення) - циклічний поліпептид з вираженою імуносупресивною дією, який пригнічує розвиток реакцій клітинного типу і Т-залежне утворення антитіл. В наших дослідженнях застосування циклоспорину А сприяло зменшенню проявів імунних реакцій алогенного та нейроаутоімунного спрямування.

Таким чином, при внутрішньоочеревинному введенні фетальних нейроклітин індукуються алоцитотоксичні клітинні та гуморальні реакції, а також імунна відповідь до специфічних нейроантигенів. Застосування імуносупресорного препарату сандімун дозволяє послабити прояви реакцій клітинного алоімунітету та рівень гуморальної сенсибілізаці при введенні в організм клітин ембріонального та фетального мозку.

ВИСНОВКИ

1.Клітинні алоімунні реакції розвиваються з 6-ї по 37-у добу після внутрішньоочеревинного введення фетальних НКП (Е13-15) з максимальним рівнем на 6-у добу і подальшим зниженням до 37-ї доби. Інтенсивність клітинної алоімунної відповіді на фетальні НКП є нижчою за відповідь на клітини лімфовузлів дорослих тварин.

2.При внутрішньоочеревинному введенні всіх досліджуваних типів клітин гуморальні алоімунні реакції наростають до 12-ї доби і мають різну інтенсивність в залежності від типу введених клітин: більш високий рівень алоантитіл зареєстровано у групі тварин із введенням клітин лімфовузлів дорослих тварин, достовірно нижчий - у групі тварин із введенням фетальних НКП (Е13-15).

3.Після системного введення клітин нами зафіксовано підвищений рівень антитіл до ОБМ (18-а доба) та S-100 (37-у доба) у тварин з введенням фетальних НКП (Е13-15), що свідчить про потенціальну можливість розвитку нейроспецифічних аутоімунних реакцій після внутрішньоочеревинного введення попередників НК.

4.Імуносупресивний препарат сандімун гальмує клітинну алоімунну та, частково, аутоімунну відповідь на системне введення алогенних фетальних НКП при використанні триразового введення препарату в дозі 100 мкг.

5.Фетальні НКП розпізнаються і викликають клітинну та гуморальну імунну відповідь в алогенній системі in vivo, інтенсивність якої нижча у порівнянні з відповіддю на лімфоцити, що свідчить про значно менший рівень експресії антигенів гістосумісності фетальними НКП, але цей рівень достатній для активації периферичних лімфоцитів реципієнта та індукції алоімунної відповіді.