Файл: Практикум для студентов специальности 154 01 03 Физикохимические ме тоды и приборы контроля качества продукции.pdf

нефтяном загрязнении. Анализ указанных углеводородных фракций осу- ществляют газовой хроматографией, при которой определяют содержание в образце отдельных компонентов фракций.
Лабораторная работа № 17
ОПРЕДЕЛЕНИЕ МАССОВОЙ ДОЛИ БЕНЗ(А)ПИРЕНА
Цель работы: освоить методики определения ароматических угле- водородов определить содержание бенз(а)пирена в пищевых продуктах методом спектрофлуориметрии при комнатной температуре.
Средства испытаний: флуоресцентный спектрометр со спектраль- ным диапазоном длин волн 300–460 нм с кюветами вместимостью 0,4 см
3
; весы лабораторные 2-го класса точности с наибольшим пределом взвеши- вания 200 г; испаритель ротационный; баня водяная; камера хроматогра- фическая 40·40·40 см; осветитель ультрафиолетовый; пластины стеклянные
20·20 см для тонкослойной хроматографии; колонка стеклянная хромато- графическая длиной 500 мм и диаметром 20 мм с оттянутым внизу концом и резервуаром вместимостью 50–60 см
3
ПЩ 14/23; линейка измерительная ценой деления 0,1 см; целлюлоза микрокристаллическая для хроматогра- фии; силикагель для хроматографии; сефадекс.
1. Общие сведения
Определение содержания бенз(а)пирена осушествляется с использо- ванием спектрофлуориметра, в основе работы которого положено явление люминисценции.
Люминесцентный метод исследования различных объектов основан на наблюдении их люминесценции. При люминесцентном анализе наблю- дают либо собственное свечение исследуемых объектов (например, паров исследуемого газа), либо свечение специальных люминофоров, которыми обрабатывают исследуемый объект. Аппаратура, применяемая длялюми- несцентного анализа, содержит источник возбуждения люминесценции и регистрирующее устройство. Чаще всего возбуждают фотолюминесцен- цию объекта, однако в некоторых случаях наблюдают катодолюминесцен- цию, радиолюминесценцию и хемилюминесценцию. Фотовозбуждение обычно производится кварцевыми ртутными лампами, причем с помощью светофильтров из их спектра обычно вырезается ультрафиолетовая часть.
Кроме ртутных ламп, в качестве источника света в люминесцентном ана- лизе применяют ксеноновые лампы, искры в воздухе, лазеры. Регистрация люминесценции обычно осуществляется визуально или с помощью фото- электронных приборов, которые повышают точность метода.
По длительности люминисцентного свечения различают: флуорес- ценцию (свечение длится после удаления источника излучения 10
–10
–10
–12
). и фосфоресценцию (свечение продолжается от долей секунд до нескольких минут и даже часов).
При количественном и качественном химическом люминесцентном

анализерегистрируется чаще всего самостоятельное свечение веществ. С помощью количественного анализа по интенсивности света люминесцен- ции определяют концентрацию люминесцирующего вещества (при малых оптических толщинах его и концентрациях, меньших 10
–4
-10
–5
г/см
3
). Чув- ствительность количественного люминесцентного анализа очень велика и достигает нескольких единиц на 10
–10
г/см
3
при обнаружении ряда органи- ческих веществ. Это позволяет использовать люминесцентный анализ для контроля чистоты веществ
Качественный химический люминесцентный анализпозволяет обна- руживать и идентифицировать некоторые вещества в смесях. В этом слу- чае с помощью спектрофотометров изучают распределение энергии в спектре люминесценции веществ.
Некоторые нелюминесцирующие вещества обнаруживают по люми- несценции продуктов их взаимодействия со специально добавляемыми веществами.
Внешний вид спектрофлуориметра СМ 2203 представлен на рис. 15.
Спектрофлуориметр СМ 2203 для ультрафиолетовой и видимой об- ласти спектра предназначен для высокочувствительного и стабильного из- мерения спектров возбуждения, испускания, синхронных, поляризации,
температурных, квантового выхода, поглощения жидких и твердых образ- цов. Прибор СМ 2203 полностью управляется от компьютера.
Рис. 15. Спектрофлуориметр СМ 2203
Спетрофлуориметрический метод определения содержания бенз(а)- пирена заключается в экстракции углеводородов, в том числе и бенз(а)- пирена, гексаном из продукта, предварительно обработанного спиртовым раствором едкого калия, выделении фракции полициклических ароматиче- ских углеводородов, содержащих бенз(а)пирен, очистке полученной фрак- ции от мешающих примесей на колонке с сефадексом и в тонком слое аце- тилированной целлюлозы с последующим количественным определением выделившегося бенз(а)пирена высокоэффективной жидкостной хромато- графией.

2. Порядок проведения испытаний
Подготовка к испытаниям.Приготовление растворителей. Все используемые органические растворители перегоняют общепринятым спо- собом с дефлегматором.
Приготовление стандартного раствора бенз(а)пирена концен-
трацией 100 мкг/см
3
. Отвешивают (20±0,2) мг бенз(а)пирена. Навеску ко- личественно переносят в мерную колбу вместимостью 100 см
3
бензолом, объем доводят бензолом до метки.
Приготовление рабочего раствора бенз(а)пирена концентрацией
1,0 мкг/см
3
. Готовят разведением стандартного раствора в 100 раз.
Приготовление ацетилированной целлюлозы. (50,0±2,0) г микрокри- сталлической целлюлозы помещают в плоскодонную колбу вместимостью
500 см
3
, добавляют приготовленную в отдельной колбе смесь 150 см
3 бен- зола или толуола, 70 см
3
уксусного ангидрида и 0,3 см
3 серной кислоты.
Реакционную смесь перемешивают магнитной мешалкой в течение 6–8 ч, оставляют без перемешивания еще на 18 ч, после чего декантируют жид- кую фазу, а остаток заливают 300 см
3 этилового спирта, перемешивают и оставляют на 24 ч. Затем целлюлозу отфильтровывают на воронке Бюхне- ра, промывают 100 см
3
этилового спирта и дистиллированной водой до нейтральной реакции промывных вод.
Проверяют хроматорафическую активность ацетилированной цел- люлозы. Готовят смесь этилового спирта, ацетона и воды (60 : 25 : 15) и выливают ее в выстланную полосками фильтровальной бумаги хромато- графическую камеру. Высота соя растворителя 1,5–2 см. 1,5 г ацетилиро- ванной целлюлозы суспензируют в 7 см
3
этилового спирта и выливают суспензию ровным слоем на стеклянную пластину 5·20 см, дают раствори- телю полностью испариться на воздухе и наносят на пластинку в точку
5 мкл раствора бенз(а)пирена массовой концентрацией 1 мкл/см
3
. Пласти- ну помещают в хроматографическую камеру и оставляют в камере до тех пор, пока уровень растворителя поднимется не менее чем на 100 мм от ли- нии старта. По окончании хроматографии пластину вынимают, высушива- ют на воздухе и под лампой ультрафиолетового облучателя отмечают флуоресцирующее голубым цветом пятно бенз(а)пирена. Измеряют рас- стояне от стартовой линии до фронта растворителя и до середины пятна бенз(а)пирена, рассчитывают значение R
f
, оценивающее скорость переме- щения бенз(а)пирена по пластинке, согласно формуле
L
L
R
f
БП

, где L
БП
– расстояние от стартовой линии до середины пятна бенз(а)пирена, мм; L – расстояние от стартовой линии до фронта растворителя, мм.
Значение R
f
бенз(а)пирена должно составлять 0,1.
Для приготовления пластинки 5 г ацетилированной целлюлозы сус- пензируют в 20 см
3
этилового спирта и наносят равным слоем на стеклян- ную пластинку 20·20 см.

Проведение испытаний.Щелочной гидролиз и экстракция неомы-
ляемой фракции липидов. 10 г измельченного продукта помещают в плос- кодонную колбу вместимостью 100 см
3
, добавляют раствор 4 г гидроокиси калия в 50 см
3 92%-ного этилового спирта.
Содержимое колбы перемешивают встряхиванием. Колбу присоеди- няют к обратному холодильнику и нагревают при кипении реакционной массы и перемешивании на магнитной мешалке в течение 3 ч. В колбу че- рез холодильник добавляют 100 см
3
дистиллированной воды. Полученный раствор охлаждают до комнатной температуры и переносят в делительную воронку вместимостью 500 см
3
и экстрагируют трижды по 30 см
3
гексана.
Для расслоения эмульсии можно добавить в воронку небольшое количест- во сульфата натрия. Объединенные гексановые экстракты промывают в делительной воронке дистиллированной водой трижды по 30 см
3
, перено- сят в плоскодонную колбу вместимостью 100 см
3
через слой безводного сульфата натрия на воронке с пористым фильтром. Раствор упаривают на ротационном испарителе до объема 50 см
3 при температуре водяной бани не более 60°С.
Переэкстракция ПАУ водным диметилформамидом. Упаренный экстракт переносят в делительную воронку емкостью 500 см
3
и добавляют
50 см
3
смеси диметилформамида и воды, взятых в объемном соотношении
9 : 1. Содержимое воронки интенсивно встряхивают в течение 1 мин, отде- ляют нижний слой, а из верхнего гексанового экстрагируют ПАУ повтор- но, добавив в воронку новую порцию водного диметилформамида объемом
50 см
3
. Гексановый (верхний) слой отбрасывают, а объединенный диме- тилформамидный экстракт разбавляют 100 см
3
воды и экстрагируют ПАУ из слоя разбавленного водой диметилформамида гексаном трижды по 50 см
3
. Гексановые экстракты объединяют и промывают водой (трижды по 30 см
3
), затем переносят в плоскодонную колбу с 10 г безводного сульфата натрия и сушат экстракт в течение 1 ч. Обезвоженный экстракт упаривают до объема 1,5–2 см
3
, остаток растворителя удаляют током азота или возду- ха. Вещество в колбе растворяют в 0,5 см
3
этилового спирта и очищают на колонке с сефадексом LH-20.
Хроматография на колонке с сефадексом LH-20. В стакан вместимо- стью 100 см
3
отвешивают (2,5±0,2) г сефадекса, заливают 50 см
3
этанола и оставляют для набухания на 3–4 ч, после чего гель переносят на стеклян- ную хроматографическую колонку длиной 500 мм и внутренним диамет- ром 10–15 мм со стеклянным пористым фильтром ПОР 160, дают раство- рителю стечь и переносят на колонку раствор экстракта, смывая его из колбы трижды этиловым спиртом порциями по 0,5 см
3
, каждый раз давая растворителю полностью впитаться в слой геля. Элюируют вещество с ко- лонки 40 см
3
этилового спирта.
Первую фракцию объемом 12 см
3
этилового спирта отбрасывают, вторую фракцию объемом 25 см
3
собирают, затем упаривают раствори- тель до объема 0,5–1 см
3
, остаток растворителя удаляют в потоке воздуха или азота.

Полученную фракцию, содержащую бенз(а)пирен, далее анализиру- ют спектрофлуориметрическим методом.
При определении содержания бенз(а)пирена одновременно с пробой продукта анализируют пробу контрольного опыта, в которую добавлено
50 мкл раствора бенз(а)пирена массовой концентрацией 1 мкг/см
3
Растворяют пробу в 0,5 см
3
бензола и далее подвергают фракции, со- держащие бенз(а)пирен, из пробы продукта и пробы контрольного допол- нительной очистке в тонком слое ацетилированной целлюлозы.
Для этого подготовленную пластинку размером 20·20 см делят на два поля: боковое – шириной 1,5–2 см и основное, проводя по слою сорбената скальпелем или тонким шпателем разделительную полосу. Вещество сплошной полосой наносят на подготовленную пластинку, оставляя снизу и с боков пластинки поля шириной 1,5–2,0 см. Размер пятен не должен превышать 5 мм. На стартовую линию бокового поля наносят в точку 5 мкл раствора бенз(а)пирена с концентрацией 1 мкг/см
3
. Пластинку поме- щают в хроматографическую камеру под углом 70–85° и проводят элюи- рование в смеси этилового спирта, ацетона и воды, взятых в объемном со- отношении 60 : 25 : 15. Камера должна быть предварительно насыщена па- рами растворителя в течение 2–3 ч. Когда фронт растворителя достигнет 2 см от верхнего края пластинки, ее вынимают, высушивают на воздухе и проявляют хроматографическую зону бенз(а)пирена в УФ-свете с длиной волны 360 нм. Сорбент из зоны бенз(а)пирена (которая ниже зоны бенз(к)флуорантена) собирают с помощью скальпеля и переносят на стек- лянный фильтр, с которого вещество элюируют в несколько приемов 50 см
3
бензола в колбы вместимостью 100 см
3
, далее растворитель упаривают до небольшого объема, остаток растворителя удаляют потоком воздуха и добавляют в колбу 1 см
3
бензола.
На спектрофлуориметре при длине волны возбужденного света
386 нм в диапазоне 400–440 нм при скорости сканирования 60 нм/мин записывают спектры флуоресценции пробы продукта и пробы контроль- ного опыта с добавкой бенз(а)пирена.
Спектры растворов записывают в одном режиме усиления, регулируя щель и коэффициент усиления по раствору контрольной пробы так, чтобы сигнал бенз(а)пирена при 406 нм составлял 0,4–0,6 шкалы прибора. Для каждого раствора спектр записывают дважды, добиваясь хорошей воспро- изводимости. На полученных спектрах в максимуме при 406 нм измеряют в миллиметрах высоту спектральной линии бенз(а)пирена для пробы про- дукта и пробы контрольного опыта. Рассчитывают среднее значение высот бенз(а)пирена по данным двух спектрограмм.
Проводят два параллельных определения.
Обработка результатов. Массовую долю бенз(а)пирена X
1
, %, или
Х
2
, мг/кг, в продукте рассчитывают по следующей формуле
4
ст ст ст ст
1 10 100 1000 100













m
H
V
Н
С
m
H
V
C
H
X
,

m
H
V
Н
C
X




cт cт
2
, где С
ст
– массовая концентрация бенз(а)пирена в рабочем растворе и до- бавленного в пробу контрольного опыта, мкг/см
3
; Н – высота спектральной линии бенз(а)пирена в пробе, мм; Н
ст
– высота спектральной линии бенз(а)пирена в пробе контрольного опыта, мм; V – объем рабочего рас- твора бенз(а)пирена, добавленного в пробу контрольного опыта, см
3
; m –
масса навески продукта.
Результат округляют до второй значащей цифры.
Расхождения между двумя параллельными результатами не должно превышать 0,4 от среднего арифметического.
3.4 Пищевые добавки
Пищевые добавки - вещества природного или синтетического проис- хождения, преднамеренно добавляемые в пищевой продукт с целью дос- тижения определенного технологического эффекта, увеличения сроков хранения, улучшения вкусовых и других органолептических свойств, со- вершенствования приемов технологической и кулинарной обработки пи- щевых продуктов.
Бурное развитие пищевой и химической отраслей промышленности предопределяет весьма широкое применение пищевых добавок. Они вы- полняют разнообразные функции в пищевой технологии и продуктах пи- тания.
Пищевые добавки вводятся с целью:
– совершенствования технологии подготовки и переработки пищево- го сырья, изготовления, фасовки, транспортировки и хранения продуктов питания. Применяемые при этом добавки не должны маскировать послед- ствий использования некачественного или испорченного сырья, или про- ведения технологических операций в антисанитарных условиях;
– сохранения природных качеств пищевого продукта;
– улучшения органолептических свойств пищевых продуктов и уве- личения их стабильности при хранении.
Применение пищевых добавок допустимо только в том случае, если они даже при длительном потреблении в составе продукта не угрожают здоровью человека, и при условии, если поставленные технологические задачи не могут быть решены иным путем. Обычно пищевые добавки раз- деляют на несколько групп:
– вещества, улучшающие внешний вид пищевых продуктов (краси- тели, стабилизаторы окраски, отбеливатели);
– вещества, регулирующие вкус продукта (ароматизаторы, вкусовые добавки, подслащивающие вещества, кислоты и регуляторы кислотности);
– вещества, регулирующие консистенцию и формирующие текстуру
(загустители, гелеобразователи, стабилизаторы, эмульгаторы и др.);