дом диагностики дифтерии. Материал засевают на кровяной агар и элективные питательные среды, содержащие теллурит: среда Клауберга (питательный агар с теллуритом натрия, гли­церином и дефибринированной кровью) и др. На средах с теллуритом задерживается рост кокков и другой микрофлоры зева, что способствует размножению возбудителя дифтерии. На теллуритовой среде C.diphtheriae образует черные колонии (рис. 14.2.1; на вклейке) за счет восстановления теллурита (биовар gravis формирует колонии серовато-черного цвета с радиальной исчерченностью поверхности, напоминающие цве­ток маргаритки, биовар mitis — круглые выпуклые колонии черного цвета). Типичные колонии, представленные грамполо-жительными палочками булавовидной формы с характерным расположением, содержащими зерна волютина, пересевают на кровяной агар для получения чистой культуры.

Для подтверждения диагноза дифтерии в первую очередь необходимо установить токсигенность выделенной культуры (способность к продукции дифтерийного токсина). Наличие токсина определяют с помощью различных серологических реакций (преципитации в агаре, ИФА и др.). Применяют также метод ПЦР, позволяющий обнаружить присутствие у выделен­ных бактерий tox-гена, контролирующего синтез дифтерийного токсина. До последнего времени общепринятым методом оп­ределения токсигенности являлась реакция преципитации в агаре с антитоксической противодифтерийной сывороткой. Методы ИФА и ПЦР, разработанные в последние годы, явля­ются более чувствительными и позволяют получить результат в течение 3—5 ч.

Определение токсигенности в реакции преципитации: в чашку Петри с питательным агаром, содержащим 15—20 % лошадиной сыворотки, 0,3 % мальтозы и 0,03 % цистина, кладут полоску фильтровальной бумаги, пропитанную анти­токсической противодифтерийной сывороткой, содержащей 5000 АЕ/мл. Чашку подсушивают при 37 "С в течение 30 мин и засевают исследуемые культуры в виде перпендикулярных к бумаге штрихов на расстоянии 0,6—0,8 см от края бумаги. В качестве контроля используют заведомо токсигенную куль­туру. Посевы инкубируют при 37 "С до следующего дня. При размножении токсигенной культуры в месте соединения ток­сина с антитоксическими антителами в плотной питательной среде образуется преципитат в виде белых линий — "усов" (см. рис. 10.1.7).

Выделенную культуру идентифицируют и дифференцируют от сходных с ней непатогенных коринебактерий по морфоло­гическим особенностям, культуральным и биохимическим признакам: пробы на цистиназу, уреазу, ферментация углево­дов и др. (табл. 14.2.3). В случае выделения нетоксигенной культуры ставят дополнительную реакцию агглютинации с

---

Вид Ферментация (2 ^ « 1 s 8 s 5 Р i 1 1 1 1 _ С в о Я « в s яб"-0-? II 1 1 | 1 1 1 | iSlI л! ^ е 1 s- (2 я ^ Ilig C.diphlheriae биовар ^rav/5 + — — + + + +— + биовар mitis + + — + — ± + — + C.xerosis ± _ + + — — ±— — C.pseudodiphtheriticum ± ______+ _

---

Применяют для обнаружения антигенов N.meningitidis в спин­номозговой жидкости в РИГА.

Коклюшная вакцина. Содержит взвесь В.pertussis, убитых формалином. Применяют для обязательной активной специ­фической профилактики коклюша. Входит в состав АКДС (ад­сорбированная коклюшно-дифтерийно-столбнячная вакцина), которая включает также очищенные концентрированные диф­терийный и столбнячный анатоксины, адсорбированные на гидрате оксида алюминия.

Иммуноглобулин нормальный человеческий. Получен из пла­центарной или венозной крови человека. Содержит специфи­ческие антитела против возбудителей многих инфекционных заболеваний, в том числе возбудителя коклюша. Применяют для создания пассивного иммунитета с целью профилактики и лечения коклюша.

Агглютинирующие адсорбированные (факторные) сыворотки. Применяют для серологической дифференциации возбудите­лей коклюша.

Дифтерийный адсорбированный очищенный анатоксин (АД). Дифтерийный экзотоксин обезвреживают формалином при на­гревании, а затем очищают от балластных веществ, концент­рируют и адсорбируют на гидрате оксида алюминия. Приме­няют для профилактики дифтерии путем создания активного иммунитета. Входит в состав адсорбированного дифтерийно-столбнячного анатоксина (АДС) и АКДС.

Противодифтерийная антитоксическая сыворотка. Получена из крови лошадей, гипериммунизированных дифтерийным ана­токсином, очищена и концентрирована методом диаферм-3. Активность сыворотки изменяется в международных единицах. Применяют для экстренной профилактики и лечения дифте­рии за счет создания пассивного иммунитета.

Агглютинирующая противодифтерийная сыворотка (полива­лентная и типовые). Применяют для дифференциации C.diph-theriae от дифтероидов.

Антимикробные препараты: пенициллин и другие р-лактамы, хлорамфеникол, рифампицин, сульфаниламиды, тетрациклин, эритромицин.

Тема 14.3. ВОЗБУДИТЕЛИ ТУБЕРКУЛЕЗА, ПРОКАЗЫ И АКТИНОМИКОЗА

План

Программа

1. Биологические свойства возбудителей туберкулеза, микобактериозов, проказы и актиномикозов; их пато-генность, экология, особенности инфекции и эпиде­миология вызываемых заболеваний.

Микробиологическая диагностика.

Диагностические, профилактические и лечебные пре­параты.

Демонстрация

1. Мазки для микроскопии:

Mycobacterium tuberculosis — мазки из чистой куль­туры и мокроты, окраска по методу Циля—Ниль­сена;

препарат М.tuberculosis в люминесцентном микроскопе;

Mycobacterium leprae — мазок со слизистой оболоч­ки носа, окраска по методу Циля—Нильсена;

Actinomyces spp. — друзы актиномицетов в ткани легкого.

Питательные среды для культивирования М.tuberculo­sis.

Рост микобактерий на среде Левенштейна—Йенсена.

Ниациновая проба для идентификации М.tuberculosis.

Определение чувствительности микобактерий к противотуберкулезным препаратам.

Рост актиномицетов на питательных средах.

---

Биохимические признаки для дифференциации акти­номицетов.

РСК для серодиагностики актиномикоза.

Задание студентам

1. Микробиологическое исследование при туберкулезе:

указать материал, подлежащий исследованию;

бактериоскопический метод: окрасить по методу Циля—Нильсена приготовленные из мокроты маз­ки и провести микроскопическое исследование. Сде­лать заключение и наметить ход дальнейшего ис­следования для подтверждения бактериоскопического диагноза;

бактериологический метод:

4 отметить характер роста исследуемой культуры

на среде Левенштейна—Йенсена, Ф отметить результаты ниациновой пробы, 4 определить чувствительность М.tuberculosis к ан­тимикробным препаратам: отметить наличие или отсутствие, роста микобактерий на среде Левен­штейна—Йенсена с разными концентрациями противотуберкулезных препаратов и сопоставить полученные данные с клиническими границами устойчивости микобактерий. Дать окончательное заключение по проведенным исследованиям.

2. Микроскопическое исследование при проказе:

1) указать материал, подлежащий исследованию;

2) бактериоскопический метод: микроскопировать и зарисовать окрашенный по методу Циля—Нильсе­на мазок со слизистой оболочки. Сделать заключе­ние. 3. Микробиологическое исследование при актиномикозе:

указать материал, подлежащий исследованию;

бактериоскопический метод: микроскопировать пре­парат из патологического материала. Сделать за­ключение;

бактериологический метод: на основании результа­тов исследования (морфологических, культуральных и биохимических свойств) идентифицировать культуру актиномицетов. Сделать окончательное за­ключение.

а Методические указания

• Микробиологическая диагностика туберкулеза

МАТЕРИАЛ ДЛЯ ИССЛЕДОВАНИЯ: при легочном тубер­кулезе материалом для исследования являются мокрота, про­мывные воды бронхов, бронхоальвеолярная жидкость, плев­ральный экссудат, промывные воды желудка. Образцы мокро­ты необходимо собирать в течение 3—6 дней. Если пациент откашливает недостаточное количество мокроты, отделение можно облегчить (индуцировать) путем вдыхания аэрозоля по­догретого гипертонического (5—15 %) раствора поваренной со­ли. При внелегочном туберкулезе материал для исследования выбирают в зависимости от локализации поражений. Это мо­жет быть кровь, спинномозговая жидкость, моча, синовиаль­ная жидкость, тканевые биоптаты (лимфатических узлов, кост­ного мозга, печени, кожи и подкожной жировой клетчатки и др.), испражнения. Нестерильный материал, контаминирован-ный нормальной микрофлорой (мокрота, промывные воды бронхов, бронхоальвеолярная жидкость, промывные воды же­лудка, материал из пораженных участков кожи и подкожной жировой клетчатки, испражнения) для предотвращения раз­множения посторонних бактерий сразу после отбора должен быть помещен в холодильник и храниться до исследования при температуре 4—8 °С.

---

МЕТОДЫ ДИАГНОСТИКИ:

Первичная обработка клинического материала. Нестерильный материал нуждается в предварительной деконтаминации (унич­тожении посторонней микрофлоры). Для исследования вязко­го и негомогенного материала, содержащего тканевой детрит (мокрота, бронхоальвеолярная жидкость и др.), требуется также произвести процедуру разжижения и гомогенизации. По­скольку клинические образцы обычно содержат малое количе­ство микобактерий, желательно производить обогащение ис­следуемого материала. Обычно с целью гомогенизации/декон-таминации материал обрабатывают муколитическими (М-аце-тил-Ь-цистеин) и антибактериальными агентами (10 % Na₃PO₄, 1—2 % NaOH и др.). Далее бактерии концентрируют путем осаждения (центрифугирование 15—20 мин при 3000 g). При этом клеточный детрит и погибшие посторонние микроорга­низмы удаляются в виде супернатанта. Осадок ресуспендируют в минимальном объеме стерильной воды или изотонического раствора хлорида натрия и используют для дальнейшего иссле­дования. Применяют и другие методы деконтаминации, гомо­генизации и обогащения материала. Тканевые биоптаты перед исследованием необходимо гомогенизировать.

Бактериоскопическое исследование (схема 14.3.1). Бактерио-скопическая диагностика туберкулеза основана на выявлении в материале кислотоустойчивых бактерий с помощью специ­альных сложных методов окраски.

Выявление микобактерий классическим методом Циля— Нильсена является весьма трудоемкой процедурой. Кислото­устойчивые бактерии окрашиваются в ярко-красный цвет, рас­полагаются поодиночке или небольшими скоплениями (см. рис. 2.2.2). Препараты из мочи обязательно обесцвечивают не только кислотой, но и спиртом для дифференциации M.tuber-culosis от M.smegmatis, которые могут находиться в моче здоро­вых людей. В отличие от М.tuberculosis они обесцвечиваются спиртом. Мазок исследуют иммерсионным методом при уве­личении 900х—ЮООх, просматривая до 300 полей зрения. Ре­зультат считается положительным при обнаружении 1 или бо­лее кислотоустойчивых бактерий на 100 полей зрения. Отсут­ствие кислотоустойчивых бактерий при просмотре 300 полей зрения следует трактовать как отрицательный результат. Ок­раску по методу Циля—Нильсена применяют преимуществен­но для изучения выделенных чистых культур.

В качестве основного метода выявления микобактерий в материале от больного в настоящее время применяют люми­несцентную микроскопию мазков, окрашенных флюорохро-мом аурамином О по методу Боя (последующая обработка 3 % раствором НС1 в абсолютном этаноле обеспечивает обесцвечи­вание некислотоустойчивых бактерий). Этот метод облегчает исследование, поскольку позволяет использовать меньшее уве­личение (250х или 450х) и просматривать меньшее число полей зрения (30—70 в зависимости от увеличения).

---

Смотрите также файлы

• ГИПЕРТЕНЗИЯ, Эклампсия.doc

• ДИВ.doc

• ВЗРП.doc

• Внутриутробная задержка развития плода.doc

• Антенатальный 20уход_24Nov[1].doc