ВУЗ: Не указан
Категория: Не указан
Дисциплина: Не указана
Добавлен: 08.09.2021
Просмотров: 6512
Скачиваний: 255
Независимо от метода окраски бактериоскопическое исследование позволяет обнаружить бактерии при их концентрации не менее 5000—10 000 в 1 мл образца, поэтому отрицательный результат не позволяет исключить заболевание.
Микроскопическое исследование является ориентировоч* ным и дает возможность судить лишь о наличии в материале кислотоустойчивых бактерий без определения их видовой при* надлежности. Метод не позволяет дифференцировать микобак-терии между собой и от других кислотоустойчивых микроорганизмов. Легочные и внелегочные поражения в первую очередь у лиц с иммунодефицитом различной этиологии могут быть вызваны не только бактериями комплекса Mycobacterium tuberculosis (МТС), но также и нетуберкулезными микобакте-риями: бактериями комплекса M.avium (MAC), M.kansassii, реже другими представителями рода Mycobacterium, Поскольку нетуберкулезные микобактерии являются обитателями окружающей среды, загрязняющими воду, продукты, системы принудительной вентиляции/кондиционирования воздуха и др., они могут также присутствовать в образце как контами-нанты.
Бактериоскопическое исследование считается оптимальным методом ориентировочной экспресс-диагностики туберкулеза.
Бактериологическое исследование. Считается ведущим методом диагностики туберкулеза, поскольку обладает достаточно высокой чувствительностью, специфичностью и обеспечивает материал (чистую культуру), необходимый для определения чувствительности возбудителя к противомикробным препаратам.
Для выделения чистой культуры микобактерии производят посев исследуемого материала на специальные жидкие или плотные питательные среды. Для выделения микобактерии из нестерильного материала желательно использовать селективные среды, содержащие антимикробные препараты, подавляющие рост посторонних микробов. Для культивирования микобактерии применяют плотные яичные (среда Левенштейна— Йенсена) и агаровые среды, а также ряд синтетических жидких питательных сред.
Среда Левенштейна—Йенсена готовится из суспензии свежих яиц, картофельной муки, глицерина, аспарагина, Ю^РОф сульфата и цитрата магния и малахитового зеленого. Среду свертывают в наклонном положении при 85 "С в течение 45 мин.
Большинство питательных сред выпускаются микробиологической промышленностью в виде полуфабрикатов или в готовом виде. Поскольку на жидких средах скорость роста микобактерии выше, чем на плотных, для ускорения исследования рекомендуется осуществлять посев одновременно на плотную и жидкую среду. Посевы необходимо инкубировать в атмосфере с повышенным содержанием СС>2 (5—10 %). Минимальный срок инкубации составляет не менее 8 нед. Посевы первый раз просматривают на 3—5-й день после внесения материала, далее — 2 раза в неделю. Начиная с 5-й недели культивирования — 1 раз в неделю. Культуры М.tuberculosis имеют вид сероватого или светло-кремового морщинистого или крошкообразного сухого налета (рис. 14.3.1; на вклейке). Еще до появления видимых невооруженным глазом макроскопических колоний на плотных средах с помощью микроскопии могут быть обнаружены микроколонии. Отсутствие микробного роста через 8 нед культивирования следует расценивать как отрицательный результат.
В последнее время широкое применение нашли также различные коммерческие системы культивирования микобакте-рий, использующие как жидкие, так и плотные питательные среды, а также различные высокочувствительные способы автоматизированного контроля роста бактерий на основании их метаболической активности — по потреблению компонентов питательной среды и/или образованию продуктов жизнедеятельности. Это позволяет обнаружить присутствие бактерий значительно раньше появления видимых признаков роста. Для посева используют стандартные емкости, заполненные готовой средой. Определение концентрации соответствующего метаболита в каждой пробе осуществляется непрерывно с помощью радиометрических, флюорометрических, колориметрических, манометрических или других методов в специальной камере для инкубации посевов, регистрируется и анализируется с помощью компьютера. В настоящее время изотопные методы контроля роста вытесняются неизотопными, основанными на различных способах детекции поглощения и выделения газов (О2 и/или СО2) микроорганизмами в ходе активного метаболизма. Использование указанных методов контроля роста позволяет в большинстве случаев существенно ускорить процесс выделения чистой культуры микобактерий. Положительный результат может быть получен уже через 3—5 дней, средний срок составляет 7—14 дней. Однако, учитывая вероятную низкую концентрацию возбудителя в исследуемом материале, максимальный срок инкубации достаточно велик — результат бактериологического исследования считается отрицательным при отсутствии признаков роста в течение 40 дней. В случае регистрации положительного результата культивирование продолжают до тех пор, когда количество бактерий в среде достигает определенной концентрации, необходимой для проведения дальнейшего изучения выделенной чистой культуры — идентификации и определения чувствительности к антимикробным препаратам. Среднее время культивирования составляет 9—20 дней.
Бактериологический метод дает положительный результат при наличии не менее 10—30 жизнеспособных микобактерий в 1 мл исследуемого материала после обогащения. Чувствительность бактериологического метода приближается к 100 %, однако не всегда позволяет однозначно исключить заболевание.
Отрицательный результат в ряде случаев может быть обусловлен очень низким содержанием возбудителя в клиническом образце.
Идентификация чистой культуры. Выделенные чистые культуры микобактерий обычно идентифицируют до вида. Идентификация осуществляется с помощью традиционных методов (на основании фенотипических признаков бактерий — культуральных и биохимических), а также с использованием молекулярно-генетических и химических методов анализа выделенной культуры.
Традиционные методы идентификации основаны на изучении достаточно большого числа признаков, включая скорость роста, морфологию колоний, способность к пигментообразо-ванию, продукции никотиновой кислоты, восстановлению нитратов и теллурита калия, гидролизу твина-80, мочевины (уре-азная активность), пиразинамида до пиразиновой кислоты (пиразинамидазная активность), перекиси водорода при повышенной температуре (термоустойчивая каталазная активность) и некоторых других. На основании этих признаков можно однозначно идентифицировать представителей основных видов Mycobacterium spp., вызывающих заболевания человека. Процедура идентификации по фенотипическим признакам может занимать до 3 нед. Специфичность метода составляет 100%.
Способность исследуемой культуры синтезировать никотиновую кислоту (ниациновая проба Конно) является одним из важных признаков, с помощью которого удается отличить М. tuberculosis, хорошо синтезирующие никотиновую кислоту, от M.bovis, образующих ее в минимальных количествах. Для определения ниацина к культуре микобактерий в жидкой питательной среде добавляют 1 мл раствора KCN и 1 мл 5 % раствора хлорамина. При наличии ниацина через несколько минут появляется ярко-желтая окраска. Для нейтрализации KCN после учета результатов реакции в пробирки добавляют 3—5 мл 10 % раствора гидрокарбоната натрия.
При выращивании микобактерий на предметных стеклах (метод микрокультур Прайса) вирулентные штаммы характеризуются ростом в виде жгутов или кос за счет образования корд-фактора (рис. 14.3.2; на вклейке). На нескольких предметных стеклах делают толстые мазки, высушивают, обрабатывают несколько минут 2—6 % серной кислотой и нейтрализуют. Затем стекла опускают во флаконы с гемолизированной цит-ратной кровью в разведении 1:4—1:8 и ставят в термостат. Через 7—14 дней извлекают стекла, фиксируют препарат, окрашивают по методу Циля—Нильсена и микроскопируют.
Идентификация микобактерий методом гибридизации ДНК ("ДНК-зондов"). Метод гибридизации ДНК применяют для быстрой идентификации чистой культуры микобактерий. Использование ДНК-зондов позволяет получить окончательный ответ в течение суток после завершения культивирования и, таким образом, существенно сокращает общий срок исследования. На сегодня существуют ДНК-зонды для идентификации только наиболее клинически значимых и широко распространенных микобактерий, вызывающих заболевания человека: комплекса M.tuberculosis, комплекса M.avium и M.kansassii. Таким образом, метод позволяет надежно идентифицировать представителей указанных видов и дифференцировать их от других патогенных микобактерий, а также от непатогенных сапрофитов, загрязняющих клинические образцы. Метод основан на гибридизации материала из чистой культуры с меченым ДНК-зондом, комплементарным видоспеци-фическим последовательностям в составе рРНК бактерий. Образовавшиеся в результате гибридизации ДНК-РНК-комплексы выявляют по наличию метки. Обычно используют флюоресцентную метку, присутствие которой легко обнаружить с помощью флюориметрии. Для надежной идентификации требуется не менее 105 бактерий. При этом чувствительность и специфичность метода составляют 100 %.
При высоком содержании возбудителя в клиническом образце использование коммерческих систем культивирования в сочетании с гибридизацией ДНК позволяет получить окончательный результат бактериологического исследования уже на 4—7-й день.
Идентификация микобактерий по липидному составу (хе моидентификация). Анализ количественного и качественного состава липидов клеточной стенки микобактерий (миколовых кислот) осуществляют с помощью газожидкостной или жидкостной хроматографии. Метод позволяет осуществить идентификацию любого из известных 50 видов микобактерий в течение 4 ч. Основными факторами, ограничивающими его широкое применение, являются необходимость использования дорогостоящего оборудования и техническая сложность интерпретации результатов.
Определение чувствительности возбудителя к антимикробным препаратам. Является обязательным этапом микробиологической диагностики туберкулеза и основой назначения адекватной этиотропной терапии. Традиционно определение чувствительности микобактерий осуществляют методом серийных разведений препарата в питательной среде. Наиболее надежным считается использование плотных питательных сред с последующим подсчетом числа выросших колоний. Исследование может занимать более 3 нед (до 3 мес), что обусловлено чрезвычайно низкой скоростью роста резистентных вариантов. Клинические границы устойчивости М.tuberculosis (МПК): стрептомицин — 5 мкг/мл, ПАСК — 10 мкг/мл, туба-зид — 1 мкг/мл, циклосерин и этионамид — 30 мкг/мл. Бактерии считают резистентными в том случае, если более 1 % клеток чистой культуры сохраняет способность к образованию колоний в присутствии указанной концентрации препарата.
Применение современных методов контроля роста бактерий (см. выше) позволило существенно сократить срок исследования (до 7—14 дней). Однако следует учитывать, что определение жизнеспособности бактерий в присутствии антибиотика по интенсивности их метаболической активности не всегда позволяет надежно дифференцировать чувствительную культуру от смешанной, содержащей 1—10 % резистентных бактерий. В настоящее время осуществляется интенсивная разработка более надежных методов контроля жизнеспособности, основанных на прямом подсчете числа живых бактерий с использованием проточной цитофлюориметрии, позволяющих избежать подобных ошибок.
Молекулярно-генетические методы определения чувствительности микобактерий к антимикробным препаратам. Методы ПЦР-диагностики позволяют обнаружить наличие у возбудителя генов, контролирующих резис-тентность к определенному препарату. Уже разработаны тест-системы на основе ПЦР для определения резистентности к препаратам группы рифампицинов.
Биопроба. Ранее для диагностики туберкулеза применяли биопробу: чистую культуру М. tuberculosis выделяли из органов животного, зараженного исследуемым материалом. Исследуемый материал обрабатывают серной кислотой для освобождения от посторонней микрофлоры, нейтрализуют и вводят подкожно в количестве 2—3 мл морской свинке и кролику с отрицательными туберкулиновыми реакциями. Через 4 мес, если животное не погибнет, его забивают, проводят макро- и микроскопическое исследование органов и делают посевы. Метод также применяется для определения вирулентности микобактерий. М.tuberculosis высокопатогенны для морских свинок и малопатогенны для кроликов. M.bovis высокопатогенны для кроликов. В настоящее время метод практически не применяется.