Все манипуляции с микробами осуществляют с помощью стерильных инструментов вблизи пламени горелки. Металли­ческую бактериологическую петлю перед использованием, по­сле каждой манипуляции и по окончании работы стерилизуют путем прокаливания в пламени горелки.

Культивирование микробов осуществляют посевом их на питательные среды с последующей инкубацией в оптимальных условиях температуры, влажности, газового состава атмосферы ^и т.д. С этой целью материал, содержащий микроорганизмы (материал от больного, из чистой культуры, из изолированной колонии и т.д.), помещают (засевают) в жидкие или на плотные среды. В последнем случае посев может быть произведен как на поверхность, так и в глубину агара уколом. Предварительно посуду (пробирку, чашки Петри и др.) надписывают, указывая Дату посева и характер посевного материала (номер исследова­ния или название культуры). В зависимости от техники посева и концентрации микробов в посевном материале бактерии на поверхности плотной питательной среды могут давать равно­мерный сплошной рост — бактериальный газон, "сливной рост" (возникает при помещении большого количества микро­организмов на ограниченный участок поверхности агара) или образовывать изолированные колонии.

Техника посева материала на плотную питательную среду. Получение изолированных колоний. Образование изолированных колоний достигается путем механического ра­зобщения микробов при посеве. С этой целью материал, взя­тый петлей, наносят на поверхность агара параллельными штрихами, чем достигается последовательное уменьшение кон­центрации бактерий вплоть до единичных клеток. Для сниже­ния концентрации бактерий можно также зигзагообразными движениями густо нанести материал на небольшой участок агара в верхней части чашки Петри, после чего петлю стери­лизуют, а материал распределяют параллельными штрихами по остальной части среды.

Другой способ состоит в приготовлении суспензии с малой концентрацией бактерий. Одну каплю такой суспензии нано­сят петлей на поверхность питательного агара в чашку Петри и тщательно втирают стерильным шпателем в среду, равномер­но распределяя материал по всей ее поверхности.

Получение бактериального газона. Посевы "га­зоном" производят шпателем на питательный агар в чашке Петри. Для этого, приоткрыв левой рукой крышку, петлей или пипеткой наносят посевной материал на поверхность питатель­ного агара. Затем проводят шпатель через пламя горелки, ос­тужают его о внутреннюю сторону крышки и растирают мате­риал по всей поверхности среды. После инкубации посева появляется равномерный сплошной рост бактерий.

Получение сливного роста. В пробирку со скошен­ным агаром вносят петлю с посевным материалом, опуская ее до конденсата в нижней части среды, и зигзагообразным дви­жением распределяют материал по скошенной поверхности агара. Вынув петлю, обжигают край пробирки и закрывают ее пробкой. Петлю стерилизуют в пламени горелки и ставят в штатив.

---

Техника стерильной работы с пробиркой и бактериологи­ческой петлей описана в теме 2.1.

Выделение чистых культур бактерий (ЧК)

I этап — получение изолированных колоний бактерий из исследуемого материала. При выделе­нии ЧК бактерий из испытуемого материала первоначально необходимо оценить концентрацию бактерий в материале. На I этапе выделения ЧК также осуществляют первоначальную идентификацию бактерий по морфологии и тинкториальным свойствам. Для решения этих задач из исследуемого материала готовят фиксированный мазок, окрашивают по методу Грама (или другими методами в зависимости от цели исследования) и микроскопируют. Если количество бактерий в поле зрения велико, исследуемый материал разводят в пробирке со стериль­ным изотоническим раствором хлорида натрия. При малом количестве бактерий в препарате весь объем образца засевают на жидкие среды обогащения с целью увеличения концентра­ции бактерий. При необходимости выделения определенного вида бактерий посев осуществляют на элективные среды.

Для выделения ЧК бактерий из испытуемого материала необходимо сначала разобщить находящиеся в нем микробы разных видов. Обычно для этого посев материала производят на плотную питательную среду таким образом, чтобы получить изолированные колонии присутствующих в нем бактерий (см. выше). После посева чашку переворачивают дном кверху, под­писывают и помещают в термостат при 37 °С на 18—24 ч.

Иногда применяют метод пластинчатых разводок, который заключается в перемешивании различных разведений исследу­емого материала с расплавленным и остуженным питательным агаром в колбе или пробирке. После этого агар разливают в чашки Петри и инкубируют в термостате.

Разделение бактерий с использованием физических и химичес­ких факторов осуществляют следующим образом. Для выделе­ния спорообразующих бактерий уничтожают неспорообразую-щие, прогревая исследуемый материал при 80 °С в течение 20 мин или подвергают кратковременному кипячению. Споры бактерий при этом сохраняются и при посеве прогретого ма­териала на питательную среду прорастают. Если материал со­держал только один вид спорообразующих бактерий, таким образом можно получить ЧК. Если материал содержал споры разных бактерий, дальнейшее выделение осуществляют стан­дартными методами.

При выделении ЧК психрофильных бактерий используют инкубацию при низких температурах, задерживающих рост со­путствующей микрофлоры. Так, например, для выделения ЧК возбудителя чумы (Yersinia pestis) посевы инкубируют при тем­пературе около 5 "С.

В ряде случаев ЧК бактерий можно получить путем подав­ления размножения части микробов в исследуемом материале воздействием на них факторами, к которым выделяемый вид устойчив. С этой целью используют антимикробные препара­ты, химические вещества и бактериофаги. В питательную среду вносят соответствующее вещество или фаг в строго определен­ной концентрации, препятствующей размножению сопутству­ющих бактерий, но не оказывающей выраженного ингибиру-ющего действия на исследуемый микроорганизм.

---

Кроме упомянутых, в бактериологической практике иногда применяют и другие методы. Например, для выделения чистой культуры бактерий рода Proteus (Proteus vulgaris) используют его способность к "ползучему" росту (метод Шукевича). При этом бактерии, засеянные в основание скошенного агара, за время культивирования распространяются по всей поверхности агара.

II этап — накопление ЧК для ее дальнейшей идентификации. II этап начинают с оценки результатов первичного посева материала и изучения кулыпуральных при­знаков выросших бактерий — особенностей их роста на пита­тельных средах.

Морфология микробных колоний является наиболее ин­формативным культуральным признаком. Колонии различают­ся по величине, форме, цвету, консистенции, контуру края, структуре и характеру поверхности (рис. 3.1.1). По величине колонии могут быть крупные (диаметр более 4—5 мм), средние (2—4 мм) и малые (1—2 мм), по форме — круглые, розеткооб-разные, листовидные и т.д. Цвет колонии зависит от выработки определенного пигмента — белого, желтого, красного и др. Ко­лонии непигментирующих бактерий бесцветны. По консистен­ции различаются сухие, влажные, сочные или слизистые коло­нии. Поверхность колонии бывает гладкой, морщинистой, ис­черченной, плоской, выпуклой, вдавленной. Край колонии может быть ровным, волнистым, бахромчатым. Колонии могут иметь аморфную, зернистую, волокнистую внутреннюю струк­туру.

При получении микробного газона характер роста бактерий может быть сухим, влажным, "ползучим", складчатым, пиг­ментированным. В жидкой питательной среде одни бактерии дают диффузное помутнение, другие характеризуются придон­ным или пристеночным ростом; некоторые культуры образуют пленки на поверхности среды, другие — осадок на дне пробир­ки, что преимущественно определяется потребностью в кисло­роде.

Для оценки результатов первичного посева исследуемого материала чашки с посевами просматривают и изучают мор­фологию выросших колоний. Для определения морфологии бактерий и их тинкториальных свойств из материала колоний разных типов готовят мазки, окрашивают по методу Грама и микроскопируют. Необходимо помнить, что родственные бак­терии могут отличаться по морфологии колоний и наоборот. Материал из изолированной колонии каждого типа пересевают в отдельные пробирки со скошенным агаром или какой-либо другой питательной средой. Для этого часть колонии снимают петлей, не задевая соседние колонии, и засевают штрихом на скошенную поверхность агара в пробирку. Для выделения и накопления чистой культуры выбирают колонии только тех бактерий, которые присутствовали в исследуемом материале. Появление колоний других бактерий может быть результатом контаминации (загрязнения) посева посторонними микробами

вследствие недостаточно строгого соблюдения стерильных ус­ловий работы.

---

Особенности культивирования анаэробных бактерий. Все ма­нипуляции со строгими анаэробами должны осуществляться в бескислородных условиях. Для этого используют герметичные настольные камеры с регулируемым газовым составом среды. Посевы производят на специальные обогатительные (электив­ные) среды для анаэробов (тиогликолевую, Китта—Тароцци). Посевы инкубируют в специальных СО₂-инкубаторах или в анаэростатах (металлических или пластмассовых контейнерах, герметично закрывающихся крышкой, снабженной патрубками для заполнения газовой смесью нужного состава), которые помещают в обычный термостат. Для инкубации небольших по объему посевов (1—2 чашки Петри) применяют пластиковые пакеты, содержащие химические генераторы газовой смеси, которые обеспечивают полное удаление кислорода из воздуш­ной среды в течение нескольких минут.

Тема 3.2. ИДЕНТИФИКАЦИЯ БАКТЕРИЙ

Введение. Идентификация — определение (установление) ви­довой принадлежности микроба. В настоящее время общепри­нятый метод идентификации основан на изучении определен­ного набора наиболее важных фенотипических признаков ис­следуемого микроорганизма. Критерием для идентификации является наличие у микроба совокупности основных призна­ков, характерных для данного вида (таксонометрических при­знаков). Установление вида производится согласно междуна­родной таксономии бактерий (Bergey's Manual of Systematic Bacteriology).

К основным видовым признакам бактерий относятся:

морфология микробной клетки;

тинкториальные свойства — особенности окрашивания с помощью простых и сложных методов окраски;

культуральные признаки — особенности роста микроба на питательных средах;

биохимические признаки — наличие у бактерий фермен­тов, необходимых для синтеза или расщепления (фер­ментации) различных химических соединений.

В бактериологической практике чаще всего изучают сахаро-литические и протеолитические ферменты.

К дополнительным признакам, используемым при идентифи­кации, относятся:

наличие видоспецифических антигенов (см. главу 10);

чувствительность к видоспецифическим бактериофагам (см. главу 5);

видовая резистентность к определенным антимикробным препаратам (см. главу 8);

для патогенных бактерий — продукция определенных факторов вирулентности (см. главу 9).

Тонкая внутривидовая идентификация до биовара (серова-ра, фаговара, ферментовара и т.д.) — типирование — основана на выявлении соответствующего маркера: антигена (серотипи-рование, см. главу 10), чувствительности к типовому бактери­офагу (фаготипирование, см. главу 5) и др.

В последние годы разработаны и начали применяться со­временные биохимические и молекулярно-биологические ме­тоды идентификации: хемоидентификация, анализ нуклеино­вых кислот: рестрикционный анализ, гибридизация, полиме-разная цепная реакция (ПЦР), риботипирование и др.

---

План занятия

Программа

Идентификация бактерий.

Изучение биохимических свойств аэробных и ана­эробных бактерий.

а Демонстрация

Незасеянный "пестрый ряд".

Варианты изменения "пестрого ряда".

"Пестрый ряд" для анаэробных бактерий.

Микрометод изучения биохимических свойств бакте­рий.

Рост бактерий, вырабатывающих пигменты.

Задание студентам

Зарисовать варианты изменения "пестрого ряда".

Оценить результаты отсева чистой культуры: отметить наличие или отсутствие роста посеянной культуры, а также присутствие посторонних бактерий.

Убедиться в чистоте выделенной культуры, для этого приготовить мазок и окрасить его по методу Грама.

Поставить каталазную пробу на стекле и оценить ее результат.

Учесть результаты определения биохимической актив­ности выделенных чистых культур.

С помощью таблицы-определителя на основании изу­ченных морфологических, тинкториальных, культуральных и ферментативных свойств идентифициро­вать выделенные микробы.

Методические указания

Биохимическая идентификация. Для оценки биохимической активности бактерий используют следующие реакции:

1) ферментацию — неполное расщепление субстрата до промежуточных продуктов, например ферментацию угле­водов с образованием органических кислот;

окисление — полное расщепление органического суб­страта до СО₂ и Н2О;

ассимиляцию (утилизацию) — использование субстрата для роста в качестве источника углерода или азота;

диссимиляцию (деградацию) субстрата;

гидролиз субстрата.

Классический (традиционный) метод идентификации мик­робов по биохимическим признакам заключается в посеве чис­той культуры на дифференциально-диагностические среды, со­держащие определенные субстраты, с целью оценки способ­ности микроорганизма ассимилировать данный субстрат или определения конечных продуктов его метаболизма. Исследова­ние занимает не менее 1 сут. Примером является оценка саха-ролитической активности бактерий (способности ферментиро­вать углеводы) с помощью посева на среды Гисса — короткий и длинный "пестрый ряд".

Идентификация бактерий по биохимическим признакам с помощью сред "пестрого ряда". Корот­кий "пестрый ряд" включает жидкие среды Гисса с моно- и дисахаридами: глюкозой, лактозой, сахарозой, мальтозой и с 6-атомным спиртом — маннитом. В длинный "пестрый ряд" наряду с перечисленными углеводами вводят среды с разнооб­разными моносахаридами (арабиноза, ксилоза, рамноза, галак­тоза и др.) и спиртами (глицерин, дульцит, инозит и др.). Для оценки способности бактерий ферментировать углевод в среды добавляют индикатор (реактив Андреде или др.), позволяющий выявить образование кислых продуктов расщепления (органи­ческих кислот), и "поплавок" для обнаружения выделения СО₂.

Чистую культуру исследуемого микроорганизма засевают пет­лей в среды "пестрого ряда". Посевы инкубируют при 37 "С в течение 18—24 ч или больше. В том случае, если бактерии ферментируют углевод до образования кислых продуктов, на­блюдается изменение цвета среды; при разложении углевода до кислоты и газообразных продуктов наряду с изменением цвета появляется пузырек газа в поплавке. Если используют среды с полужидким агаром, то образование газа регистриру­ется по разрыву столбика. При отсутствии ферментации цвет среды не меняется. Поскольку бактерии ферментируют не все, а только определенные для каждого вида углеводы, входящие в состав сред Гисса, наблюдается довольно пестрая картина, поэтому набор сред с углеводами и цветным индикатором называют "пестрым рядом" (рис. 3.2.1; на вклейке).

---

Смотрите также файлы

• ГИПЕРТЕНЗИЯ, Эклампсия.doc

• ДИВ.doc

• ВЗРП.doc

• Внутриутробная задержка развития плода.doc

• Антенатальный 20уход_24Nov[1].doc