Форма Разме- Окраска Наличие Кислого- Под-клеток ры по мето- устойчи- виж-ду Грама СПОР кап" зерен вость ность сул волю-тина

Спорообразующие бактерии (окраска по методу Шеффера—Фултона).

Зерна волютина в клетках Corynebacterium diphtheriae (окраска по методу Нейссера).

Задание студентам

Микроскопировать и дифференцировать бактерии по морфологическим и тинкториальным свойствам в го­товом препарате из смеси бактерий (окраска по методу
Грама). Зарисовать.

Самостоятельно приготовить мазки из смеси бакте­рий, окрасить по методу Грама, Микроскопировать и дифференцировать бактерии по морфологическим признакам и тинкториальным свойствам. Зарисовать.

Микроскопировать и зарисовать:

капсулы (окраска по методу Бурри—Гинса);

С.diphtheriae, содержащие зерна волютина (окраска по методу Нейссера);

кислотоустойчивые бактерии М. tuberculosis (окраска по методу Циля—Нильсена);

спорообразующие бактерии (окраска по методу Шеффера—Фултона).

4. Сделать заключение по результатам проведенных исследований.

Методические указания

Сложные методы окраски. Сложные методы окраски исполь­зуют для выявления ультраструктурных компонентов бактери­альных клеток, имеющих достаточно большие размеры (мак­рокапсулы, жгутики, цитоплазматические включения и т.д.), а также для дифференцировки (различения) бактерий в зависи­мости от химического состава и особенностей их тонкой орга­низации (ультраструктуры).

Окраска по методу Грама

На фиксированный мазок нанести карболово-спиртовой раствор генцианового фиолетового через полоску фильт­ровальной бумаги. Через 1—2 мин ее снять, а краситель
слить.

Нанести раствор Люголя на 1-2 мин.

Обесцветить этиловым спиртом в течение 30-60 с до прекращения отхождения фиолетовых струек красителя.

Промыть водой.

Докрасить водным раствором фуксина в течение 1-2 мин, промыть водой, высушить и Микроскопировать.

Грамположительные бактерии окрашиваются в темно-фио­летовый цвет, грамотрицательные — в красный (рис. 2.2.1; на вклейке). В основе этого метода лежит избирательное обесцве­чивание — удаление комплекса генцианового фиолетового с йодом под действием спирта. Результат окраски по методу Грама определяется особенностями строения и химического состава клеточной стенки бактерий и зависит от способности удерживать образовавшийся в процессе окраски комплекс генцианового фиолетового с йодом.

Фирмикутные бактерии окрашиваются грамположительно, поскольку имеют многослойный пептидогликан, связанный с тейхоевыми кислотами. Последние обусловливают прочную фиксацию красителя и резистентность к обесцвечиванию спир­том. Грациликутные бактерии окрашиваются грамотрица-тельно.

Окраска по методу Грама имеет важное дифференциально-диагностическое значение и широко используется в микробио­логии. К грамположительным бактериям относятся стафило­кокки, стрептококки, коринебактерии дифтерии и др., к грамотрицательным — гонококки, менингококки, кишечная палоч­ка и др. Некоторые виды бактерий (клостридии, гарднереллы) могут окрашиваться по методу Грама вариабельно в зависимос­ти от возраста культуры, особенностей культивирования и дру­гих факторов, воздействующих на структуру клеточной стенки.

---

Основная ошибка, допускаемая при окраске по методу Гра­ма, заключается в "переобесцвечивании" мазка этиловым спиртом. Грамположительные бактерии при этом могут утра­чивать первоначальную окраску генциановым фиолетовым и приобретать красный цвет (характерный для грамотрицатель-ных бактерий) в результате последующей докраски мазка фук­сином. Грамотрицательные бактерии в свою очередь могут сохранять сине-фиолетовый цвет генцианового фиолетового. Для правильной окраски следует строго соблюдать технику обесцвечивания.

Окраска кислотоустойчивых бактерий по методу Циля-Ниль­сена

На фиксированный мазок нанести карболовый раствор фуксина через полоску фильтровальной бумаги и подо­греть 3-5 мин до появления паров.

Снять бумагу, промыть мазок водой.

Нанести 5 % раствор серной кислоты или 3 % раствор смеси спирта с хлористоводородной кислотой на 1-2 мин. для обесцвечивания.

Промыть водой.

Докрасить мазок водным раствором метиленового синего в течение 3-5 мин.

Промыть водой, высушить и микроскопировать.

В основе метода лежат протравливание (разрыхление) кле­точной стенки бактерий для усиления поглощения красителя и избирательное обесцвечивание под действием кислоты. Кис-лотоустойчивость бактерий обусловлена особым строением их клеточной стенки с повышенным содержанием липидов: разветвленных жирных кислот (миколовых кислот), глико- и фос-фолипидов, восков. Клеточная стенка кислотоустойчивых бак­терий имеет очень низкую проницаемость, поэтому они пло­хо воспринимают красители. Раствор карболовой кислоты разрыхляет клеточную стенку и тем самым повышает ее тинк-ториальные свойства, а высокая концентрация красителя и нагревание в процессе окраски усиливают реакцию взаимодей­ствия красителя с бактериальными клетками, которые при этом окрашиваются в красный цвет. При обработке препарата серной кислотой некислотоустойчивые бактерии обесцвечива­ются и в дальнейшем окрашиваются метиленовым синим в голубой цвет, а кислотоустойчивые бактерии остаются окра­шенными фуксином в красный цвет (рис. 2.2.2; на вклейке).

Окраска спор по методу Ожешко

На нефиксированный мазок нанести 0,5 % раствор хло­ристоводородной кислоты и подогреть в течение 2-3 мин. на пламени.

Кислоту слить, препарат промыть водой, просушить и фиксировать над пламенем.

Окрасить по методу Циля-Нильсена.

Споры бактерий приобретают красный цвет, а вегетативные формы — синий (рис. 2.2.3; на вклейке). Споры бактерий име­ют многослойную клеточную стенку сложного строения, прак­тически непроницаемую для красителей, поэтому для повыше­ния их тинкториальных свойств используют более жесткие условия протравливания, чем для окрашивания кислотоустой­чивых бактерий.

Окраска спор по методу Шеффера-Фултона

На фиксированный мазок нанести 5 % раствор малахитового зеленого и 3-4 раза нагреть до появления паров.

---

Промыть водой.

Докрасить 0,5 % сафранином в течение 30 с.

4. Промыть водой, высушить и микроскопировать. Споры бактерий окрашиваются в зеленый цвет, вегетатив­ные клетки — в красный.

Окраска зерен волютина по методу Нейссера

На фиксированный мазок нанести ацетат синьки Нейссера на 2-3 мин.

Добавить раствор Люголя на 10-30 с.

Промыть препарат водой.

Докрасить водным раствором везувина или хризоидина в течение 0,5-1 мин.

Промыть препарат водой, высушить и микроскопиро­вать.

Зерна волютина представляют собой включения полифос­фатов, имеющие в отличие от цитоплазмы щелочную реакцию, и поэтому избирательно воспринимают ацетат синьки, окра­шиваясь в темно-синий цвет. Цитоплазма клетки, обладающая кислой реакцией, воспринимает щелочной краситель везувин и окрашивается в желтый цвет (рис. 2.2.4; на вклейке). Обнаружение макрокапсул по методу Бури-Гинса

Смешать каплю взвеси микробных клеток с каплей туши и при помощи стекла со шлифованым краем сделать мазок таким же образом, как мазок из крови, высушить и фиксировать.

На мазок нанести водный раствор фуксина на 1—2 мин.

Промыть водой, высушить на воздухе и микроскопировать.

Бактерии окрашиваются в красный цвет. Капсулы не окра­шиваются анилиновыми красителями, остаются прозрачными и контрастно выделяются на черно-розовом фоне (рис. 2.2.5; на вклейке).

Тема 2.3. МОРФОЛОГИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ

И УЛЬТРАСТРУКТУРА АКТИНОМИЦЕТОВ И СПИРОХЕТ

Введение. Актиномицеты (Actinomyces) относятся к порядку Actinomycetales, включающему семейства Actinomycetaceae, Strep-tomycetaceae и Nocardiaceae. Актиномицеты имеют нитевид­ную форму. Они способны к ветвлению и могут образовывать структуры, напоминающие мицелий одноклеточных грибов (рис. 2.3.1). Встречаются также палочко- и кокковидные фор­мы. Нити имеют длину 100—600 мкм и толщину 0,2—1,2 мкм. Актиномицеты неподвижны, лишены выраженной капсулы, жгутиков и пилей. Как и другие бактерии, актиномицеты ок­рашиваются простыми методами или по методу Грама. Акти­номицеты относятся к фирмикутным бактериям и окрашива­ются грамположительно. В отличие от других бактерий они способны размножаться не только поперечным делением, но и спорами.

Спирохеты относятся к порядку Spirochaetales. Они представ­ляют собой извитые подвижные бактерии. Патогенные спиро­хеты входят в семейство Spirochaetaceae и принадлежат к трем родам: Borrelia, Treponema и Leptospira. Их основные морфоло­гические признаки представлены в табл. 2.3.1.

Клетка спирохеты имеет форму нити, закрученной в виде спирали. Клеточная стенка обладает строением, типичным для грациликутных бактерий. В периплазматическом пространстве располагаются сократительные фибриллы — эндофлагеллы, которые прикрепляются к полюсам клетки с обоих концов, оплетают тело бактерии по направлению к центру клетки, где они переплетаются между собой. Фибриллы обладают сокра-

---

Таблица 2. 3.1. Морфологические признаки спирохет Род Число и характер Характер движения Окраска по методу завитков Романовского— Гимзы Borrelia 3—10, крупные, Толчкообразное, Сине-фиолетовая неравномерные сгибательно-по-ступательное Treponema 8—12, мелкие, Плавное, сгиба- Бледно-розовая равномерные тельно-поступа-тельное Leptospira Многочисленные Очень активное, Розово-сиренева-первичные завит- вращательно-по- тая ки, вторичные ступательное завитки в виде буквы S

План

Программа

Определение формы актиномицетов в препарате, ок­рашенном по методу Грама.

Методы изучения морфологии спирохет с дифферен­циацией по морфологическим признакам.

Определение формы и подвижности спирохет в при­жизненных препаратах.

Исследование спирохет в окрашенных препаратах.

Изучение электронограмм спирохет и спирилл.

Демонстрация

Препарат из чистой культуры актиномицетов. Окраскапо методу Грама.

Подвижность лептоспир (темнопольная микроскопия).

Боррелии в препарате толстой капли крови (окраска по методу Романовского-Гимзы).

а Задание студентам

Изучить морфологию актиномицетов в препарате. За­рисовать.

Изучить морфологию лептоспир с помощью методатемнопольной микроскопии. Зарисовать.

Изучить морфологию боррелий в препарате толстой капли крови. Зарисовать.

Методические указания

Морфологию спирохет изучают в нативных препаратах и в мазках, окрашенных по методу Романовского-Гимзы. Пре­параты исследуют с помощью темнопольной или фазово-кон-трастной микроскопии, наблюдая за активным и характерным движением спирохет и особенностями их формы.

Приготовление мазка из крови. На чистое обезжи­ренное стекло ближе к одному из его концов поместить каплю крови. Другое предметное стекло со шлифованым краем прижать под углом 45° к капле крови, а затем скользящим движением передвинуть его к другому концу нижнего стекла. При этом кровь распределится по предметному стеклу тонким слоем. Высушить препарат на воздухе, фиксировать в жидком фиксаторе (метило­вый спирт или смесь этилового спирта и эфира).

Окраска препарата по методу Романовского-Гимзы (смесь метиленового синего, эозина и азура). На мазок нанести рабочий раствор красителя (2 капли красителя на 1 мл дистиллированной воды) на 10—20 мин. Затем препарат про­мыть водой и высушить на воздухе.

Боррелии — возбудители возвратного тифа (B.recurrentis) окра­шиваются в фиолетовый, эритроциты крови — в розово-корич­невый, ядра лейкоцитов — в фиолетовый цвет. Трепонемы ок­рашиваются в бледно-розовый, лептоспиры — в розово-сире­неватый цвет.

Признак Риккетсии Хламидии Микоплазмы Размеры, 0,5— 4 мкм, поли- 0,25— 1,0 мкм, 0,2— 0,3 мкм, круг-форма морфны: встреча- шаровидные, ово- лые, овальные ются кокковид- идные или палоч- или нитевидные ные, палочковид- ковидные клетки* клетки ные, реже ните­видные клетки Особен- КС по типу фа- КС по типу гра- Лишены КС. Име-ности циликутных. Не циликутных; ли- ют выраженный строения имеют макрокап- шены пептидо- S-слой. Не имеют сулы, жгутиков, гликана. Не име- макрокапсулы, Неподвижны. Не ют макрокапсу- жгутиков. Не об-образуют споры лы, жгутиков. Не- разуют споры, подвижны. Не об- Подвижны за счет разуют споры внешнего цито-скелета Окраска По методу Здро- По методу Рома- — довского невского— Гимзы (микроколонии внутри клеток) Методы Световая, фазово- Световая, фазово- Электронная мик-выявле- контрастная, лю- контрастная, лю- роскопия ния минесцентная, минесцентная электронная мик- (для выявления роскопия микроколонии внутри клеток); электронная мик­роскопия

---

План

Программа

1. Изучение морфологии риккетсий, хламидий и мико-плазм.

Демонстрация

Хламидий в инфицированных клетках эпителия урет­ры, мазках-отпечатках из органов и культурах клеток.

Электронограммы риккетсий, хламидий и микоплазм.

Задание студентам

Изучить морфологию риккетсий в препарате, окрашенном по Здродовскому.

Изучить морфологию хламидий.

3. Изучить морфологию микоплазм.

Методические указания

Окраска риккетсий по методу Здродовского

Окрасить мазок разведенным фуксином Циля (10—15 ка­пель на 10 мл дистиллированной воды) в течение 5 мин.

Промыть водой.

Обработать мазок 0,5 % раствором лимонной кислоты или 0,01 % раствором хлористоводородной кислоты.

Промыть водой.

Окрасить метиленовым синим в течение 1 мин.

Промыть водой и высушить препарат.

Риккетсий, окрашенные по методу Здродовского, имеют красный цвет, цитоплазма клеток, в которых они паразитиру­ют, — голубая, ядра — синие.

Глава 3

ФИЗИОЛОГИЯ БАКТЕРИЙ

Введение. Бактерии в ходе эволюции освоили различные экологические ниши и приспособились к соответствующим источникам неорганических и органических веществ, наличию кислорода, температуре и другим факторам окружающей сре­ды. Создание условий, подходящих для выращивания (культи­вирования) микробов, необходимо для изучения их свойств и диагностики вызываемых ими заболеваний. Культивирование бактерий лежит в основе бактериологических методов иссле­дования.

Питательные среды. Применяют для выращивания (культи­вирования) микроорганизмов в лабораторных или промышлен­ных условиях. Любая питательная среда должна отвечать сле­
дующим требованиям:

— содержать все необходимые для роста и размножения бактерий вещества в легкоусвояемой форме;

— иметь оптимальные для бактерий физико-химические свойства: рН, влажность, осмолярность и др.

Компоненты питательных сред. Для построения органичес­ких компонентов микробной клетки необходимы азот, углерод, водород и кислород. Снабжение водородом и кислородом осу­ществляется за счет воды. В качестве источника углерода гете­ротрофные микроорганизмы используют органические соеди­нения, в первую очередь сахара, многоатомные спирты и ор­ганические кислоты. Источником азота могут служить неор­ганические соединения (соли аммония), а также олигопептиды и аминокислоты — продукты гидролиза белков различного про­исхождения (животного — мясо, рыба, казеин; растительного — соевые бобы, горох; микробного — дрожжи и др.).

Поскольку в состав микробных клеток входят не только органические, но и минеральные соединения, питательные среды должны содержать неорганические вещества: соедине­ния хлора, фосфора, серы, натрия, калия, кальция, магния и некоторые другие. Минеральные соли необходимы также для создания оптимальных для роста и размножения физико-хи­мических условий (рН, ионная сила и т.д.).

---

Смотрите также файлы

• ГИПЕРТЕНЗИЯ, Эклампсия.doc

• ДИВ.doc

• ВЗРП.doc

• Внутриутробная задержка развития плода.doc

• Антенатальный 20уход_24Nov[1].doc