Микробам для нормального развития необходимы микро­элементы, преимущественно металлы (железо, медь, марганец и др.), которые входят в состав простетических групп молекул различных ферментов.

Кроме основных компонентов питательной среды, для жиз­недеятельности ауксотрофных микроорганизмов, к числу ко­торых относятся многие патогенные бактерии, требуется при­сутствие факторов роста — органических соединений, входя­щих в состав микробной клетки, но не синтезируемых ею самостоятельно. В качестве факторов роста могут выступать определенные аминокислоты, азотистые основания, витамины и др. Большинство бактерий нуждается в таких факторах роста, как витамины группы В и никотиновая кислота. Для роста некоторых патогенных бактерий в питательные среды надо добавлять нативные белки (кровь, сыворотку).

Для жизнедеятельности микробной клетки, безусловно, не­обходима вода как основной растворитель и среда для проте­кания всех биохимических реакций.

В бактериологической практике используют среды, различ­ные по происхождению. Синтетическими питательными сре­дами называют такие, которые состоят из растворов химически чистых соединений в точно установленных дозировках. Пре­имуществом синтетических сред являются их строго постоян­ный состав и воспроизводимость. Полусинтетические среды включают наряду с химически чистыми соединениями перера-ботанные нативные компоненты неопределенного состава — гидролизаты мяса, дрожжевой экстракт и т.д. Натуральные питательные среды представляют собой неизмененные натив­ные (природные) компоненты (сыворотка крови, яичный белок и др.).

Различные потребнрсти микробов отдельных видов обуслов­ливают большое разнообразие питательных сред.

По консистенции питательные среды могут быть жидкими, полужидкими, плотными. Для придания плотной консистен­ции к жидкой среде добавляют агар-агар, представляющий собой продукт переработки особого вида морских водорослей. Агар-агар плавится при 80—86 °С, затвердевает при темпера­туре около 40 "С и в застывшем состоянии придает среде плот­ность. В плотные среды добавляют 1,5—2 %, в полужидкие — 0,3—0,7 % агар-агара. В некоторых случаях для получения плотных питательных сред используют нативные компоненты (свернувшаяся сыворотка крови, свернувшийся яичный белок), которые сами по себе являются плотными.

Преимуществом плотных питательных сред является воз­можность получения чистых культур микроорганизмов, а также сообществ микроорганизмов (колоний, бактериальных газо- ._s нов), имеющих макроскопические размеры.

По целевому назначению питательные среды делят на основ­ные, элективные и дифференциально-диагностические.

К основным относятся среды, применяемые для выращива­ния многих бактерий. Это триптические гидролизаты мясных, рыбных продуктов, крови животных или казеина, из которых готовят жидкую среду — питательный бульон и плотную — пи­тательный агар. Такие среды также служат основой для приго­товления сложных питательных сред — сахарных, кровяных и др., удовлетворяющих пищевые потребности патогенных бак­терий.

---

Элективные питательные среды предназначены для избира­тельного выделения и накопления микроорганизмов опреде­ленного вида (или определенной группы) из материалов, со­держащих разнообразную постороннюю микрофлору. При со­здании элективных питательных сред исходят из биологичес­ких особенностей, которые отличают данные микробы от боль­шинства других. Например, избирательный рост стафилокок­ков наблюдается при повышенной концентрации хлорида на­трия, холерного вибриона — в щелочной среде и т.д.

Дифференциально-диагностические питательные среды при­меняют для различения (дифференциации) отдельных видов (или групп) микробов. Принцип составления этих сред осно­ван на различиях в биохимической активности бактерий раз­ных видов вследствие неодинакового набора ферментов.

В состав дифференциально-диагностической среды входят следующие компоненты: а) основная питательная среда, обеспечивающая размножение бактерий, б) определенный углевод (например, лактоза), способность использовать который явля­ется диагностическим признаком для данного вида, в) цвет­ной индикатор (например, индикатор Андреде), изменение цвета которого свидетельствует о сдвиге рН среды в кислую сторону вследствие ферментации соответствующего углевода. Дифференциально-диагностические среды широко использу­ют в лабораторных микробиологических диагностических исследованиях для дифференциации и идентификации бак­терий.

Культивирование бактерий применяют, в частности, для выделения и идентификации чистых культур (схема 3.1).

а Выделение чистой культуры бактерий

Выделение отдельных видов бактерий из исследуемого ма­териала, содержащего, как правило, смесь различных микро­организмов, является одним из этапов любого бактериологи­ческого исследования, проводимого с различными целями: диагностики заболеваний, определения микробной обсеменен-ности окружающей среды и т.д.

Чистой культурой называется популяция бактерий одного вида или одной разновидности, выращенная на питательной среде. Многие виды бактерий подразделяют по одному при­знаку на биологические варианты — биовары. Биовары, разли­чающиеся по биохимическим свойствам, называют хемовара-ми, по антигенным свойствам — сероварами, по чувствитель­ности к фагу — фаговарами и т.д. Культуры микроорганизмов одного и того же вида или биовара, выделенные из различных источников либо в разное время из одного и того же источни­ка, называют штаммами, которые обычно обозначают номера­ми или какими-либо символами.

Колония представляет собой видимое изолированное сооб­щество микроорганизмов одного вида, образующееся в резуль­тате размножения одной бактериальной клетки на плотной питательной среде (на поверхности или в глубине ее).

а Методы выделения чистой культуры

---

Для выделения чистой культуры применяют методы, ос­нованные на:

механическом разобщении бактериальных клеток;

предварительной обработке исследуемого материала физическими или химическими факторами, оказыва­ ющими избирательное антибактериальное действие;

избирательном подавлении размножения сопутствую­ щей микрофлоры физическими или химическими факторами во время инкубации посевов;

способности некоторых бактерий быстро размножать­ ся в организме чувствительных к ним лабораторных животных (биопробы).

Задание студентам

Ознакомиться с питательными средами и основными ингредиентами для их изготовления.

Выполнить I этап выделения чистой культуры аэробов из исследуемого материала, содержащего смесь бакте­рий:

а) приготовить мазок из исследуемого материала и окрасить его по методу Грама, микроскопировать,
оценить морфологию присутствующих бактерий и их концентрацию;

б) засеять материал на чашку Петри с МП А, нанося материал петлей и последовательно распределяя его шпателем;

в) наметить ход дальнейшего исследования по выде­лению чистых культур аэробных бактерий.

ЗАНЯТИЕ 2

Программа

II этап выделения чистых культур аэробных бактерий.

Особенности культивирования анаэробов; характер роста анаэробов на специальных питательных средах.

Демонстрация

Различные типы колоний аэробных бактерий.

Рост чистых культур анаэробов на средах Кита-Тароцци, Вейнберга, Вильсона-Блера, молоке и тиогликолевом бульоне.

Техника отсева культуры из колоний на скошенный агар.

Задание студентам

1. Выполнить II этап выделения чистой культуры аэро­бов из материала, содержащего смесь бактерий:

а) учесть результаты посева исследуемого материала на чашке Петри с МПА, отметить наличие или отсутствие колоний, в случае неудачи проанализи­ровать ее причины;

б) определить, сколько типов колоний имеется на чашке, и зарисовать их;

в) описать по принятой схеме колонии всех типов;

г) приготовить мазки из колоний каждого типа и ок­расить их по методу Грама, микроскопировать и занести данные в протокол;

д) произвести отсев чистой культуры из колонии каж­дого типа на скошенный агар;

е) наметить план дальнейшей работы.

2. Составить план выделения чистой культуры анаэробов.

Методические указания

Основные среды. Пептоныыи бульон. Выпускается в сухом виде; состав (г/л): триптический гидролизат кильки — 10,05; натрия хлорид — 4,95.

Питательный агар. Состав (г/л): ферментативный гид­ролизат кормовых дрожжей — 12,0; агар — 12,5; натрия хло­рид - 5,5; рН 7,3+0,1.

Основные сложные среды— кровяные, сывороточные и асцитические. Их готовят путем добавления к питательному агару 5—10 % дефибринированной крови или сыворотки кро­ви либо 25 % асцитической жидкости. Для приготовления жидкой среды такие же количества сыворотки или асцитичес­кой жидкости добавляют к питательному бульону.

---

Агар Мюллера-Хинтон (основная плотная питатель­ная среда для определения чувствительности бактерий к анти­биотикам методом дисков): на 1 л дистиллированной воды 300 г мясного настоя (из говядины), 17,5 г гидролизата казеина, 1,5 г крахмала, 17 г агар-агара.

Элективные питательные среды. Пептонная вода 1 %, рН 8,0. Избирательная для холерного вибриона, который раз­множается быстро, опережая рост других микроорганизмов. Щелочная реакция среды не препятствует росту возбудителя холеры Vibrio cholerae, но тормозит рост других микроорганиз­мов.

Щелочной агар (плотная среда): питательный агар, рН 7,8, аналогично предыдущей среде элективен для V.cholerae.

Среда Леффлера. Смесь 1 части лошадиной сыворотки и 3 частей сахарного бульона, скошенная в пробирках при нагревании в аппарате Коха, элективна для возбудителя диф­терии Corynebacterium diphtheriae.

Желточно-солевой агар (ЖСА). Содержит повы­шенные концентрации хлорида натрия (8—10 %), которые не препятствуют размножению стафилококков, что обеспечивает элективность среды для данных микроорганизмов. Среда по­зволяет дифференцировать стафилококки, продуцирующие ле-цитиназу, от стафилококков, не выделяющих этот фермент, по образованию зон помутнения с перламутровым оттенком во­круг колоний лецитиназоположительных видов (фермент рас­щепляет лецитин куриного желтка, который вносится в рас­плавленный и остуженный до 45 °С питательный солевой агар).

Среды для культивирования анаэробов. Среда Вильсо­на— Блера (железосульфитный агар). Готовится из питательного агара, к которому добавляют глюкозу, Na₂SO₃, FeCl₂. Анаэробные клостридии (C.perfringens) на этой среде образуют колонии черного цвета за счет восстановления Na₂SO₃ в Na₂S, который, соединяясь с хлоридом железа, дает осадок сульфида железа (FeS) черного цвета.

Среда Китта—Тароцци. Состоит из питательного буль­она, 0,5 % глюкозы и кусочков печени или мясного фарша для адсорбции кислорода. Перед посевом среду прогревают в тече­ние 10—15 мин на кипящей водяной бане для удаления возду­ха. После посева среду заливают небольшим слоем вазелино­вого масла.

Тиогликолевый бульон с гемином (жидкая электив­ная среда для культивирования неспорообразующих анаэро­бов — представителей родов Bacteroides, Prevotella, Porphyro-monas): на 1 л дистиллированной воды 17 г гидролизата казеи­на, 3 г соевого гидролизата, 6 г глюкозы, 2,5 г хлорида натрия, 0,5 г тиогликолата натрия, 0,25 г L-цистеина, 0,1 г сульфата натрия, 5 мг гемина.

Дифференциально-диагностические среды. Среды Гисса. К 1 % пептонной воде добавляют 0,5 % раствор определенного углевода (глюкоза, лактоза, мальтоза, маннит и др.) и индика­тор Андреде (кислый фуксин в 1 н. растворе NaOH), разливают по пробиркам. В пробирки помещают поплавок (трубка длиной около 3 см, один конец которой запаян) для улавливания газообразных продуктов, образующихся при разложении угле­водов. Среда при рН 7,2—7,4 бесцветна. При разложении уг­леводов она приобретает красный цвет.

---

Среда Ресселя. Применяется при изучении биохими­ческих свойств энтеробактерий (шигелл, сальмонелл). Содер­жит питательный агар, лактозу, глюкозу и индикатор бромти-моловый синий. Приготавливают в пробирках по 6—8 мл в виде столбика со скошенной поверхностью. Цвет незасеянной среды травянисто-зеленый. Посев делают штрихом по скошен­ной поверхности и уколом в глубину столбика. Микроорганиз­мы , ферментирующие глюкозу до кислоты, вызывают измене­ние окраски столбика среды из первоначальной травянисто-зе-г леной в желтую; скошенная поверхность при этом приобретает синий цвет. Лактозоположительные микроорганизмы (Е. со//) изменяют цвет столбика и скошенной части среды в желтый, Микроорганизмы, образующие щелочь, изменяют цвет среды в синий. Газообразование отмечается в толще столбика среды.

Среда Эндо. Выпускается в виде порошка, который со­стоит из высушенного питательного агара с 1 % лактозы и индикатора — основного фуксина, обесцвеченного сульфитом натрия. Свежеприготовленная среда бесцветна или бледно-ро­зовая. При росте лактозоположительных бактерий их колонии окрашиваются в темно-красный цвет с металлическим блес-koivi; лактозоотрицательные бактерии образуют бесцветные ко­лонии.

Среда Плоскирева (б актоагар Ж). Выпускается в сухом виде и содержит питательный агар с лактозой, брилли­антовым зеленым, солями желчных кислот, минеральными со­лям: и и индикатором (нейтральный красный). Эта среда является не только дифференциально-диагностической, но и селек­тивной, так как подавляет рост многих микроорганизмов (ки­шечная палочка и др.) и способствует лучшему росту некото­рых патогенных бактерий (возбудители брюшного тифа, пара-тифов, дизентерии). Лактозоотрицательные бактерии образуют на этой среде бесцветные колонии, а лактозоположительные — красные.

Висмут-сульфит агар. Выпускается в сухом виде; со­держит триптический гидролизат кильки, глюкозу, неоргани­ческие соли, бриллиантовый зеленый, агар. Среда предназна­чена для выделения сальмонелл. Дифференцирующие свойства среды основаны на способности микроорганизмов продуциро­вать Н₂S, который вступает в реакцию с цитратом висмута и образует соединение черного цвета — сульфит висмута. Среда резко угнетает рост сопутствующей микрофлоры за счет инги-бирующего действия бриллиантового зеленого и сульфита на­трия.

Техника посевов и пересевов культур микроорганизмов. Уни­версальным инструментом для производства посевов является бактериологическая петля (металлическая многоразовая или пластмассовая одноразовая). Кроме нее, для посева уколом применяют специальную бактериологическую иглу, а для по­севов на чашки Петри — металлические, стеклянные или плас­тиковые шпатели. Для посевов жидких материалов наряду с петлей используют пастеровские и градуированные пипетки. Первые предварительно изготовляют из стерильных легкоплав­ких стеклянных трубочек, которые вытягивают на пламени в виде капилляров. Конец капилляра сразу же запаивают для сохранения стерильности. У пастеровских и градуированных пипеток широкий конец закрывают ватой, после чего их по­мещают в специальные пеналы или обертывают бумагой и стерилизуют.

---

Смотрите также файлы

• ГИПЕРТЕНЗИЯ, Эклампсия.doc

• ДИВ.doc

• ВЗРП.doc

• Внутриутробная задержка развития плода.doc

• Антенатальный 20уход_24Nov[1].doc