ВУЗ: Не указан
Категория: Не указан
Дисциплина: Не указана
Добавлен: 30.10.2019
Просмотров: 3971
Скачиваний: 33
результат
теста.
В
случае
наличия
у
возбудителя
плазмокоагулазной активности происходит свертывание плазмы,
и в пробирках образуется сгусток. При отрицательном результате
плазма остается жидкой. Для контроля используют плазму без
добавления культуры возбудителя.
Рис.18.
Тест на выявление плазмокоагулазной активности;
1 - коагулазоположительный, 2 - коагулазоотрицательный
Плазмокоагулаза
-
фермент,
который
свертывает
(коагулирует) плазму крови. В результате вокруг бактериальной
клетки
формируется
непроницаемый
для
антител
и
затрудняющий действие фагоцитов «чехол».
На занятии по основам учения об инфекции также
рассматривают теоретические основы изучения патогенных
бактерий с использованием биопробы; способы инфицирования
лабораторного животного и приготовление мазков-отпечатков из
органов трупа инфицированной мыши после гибели животного.
1. Для приготовления мазков-отпечатков вырезают из печени,
селезенки, почек небольшие кусочки ткани, берут их
пинцетом и прикасаются к предметному стеклу, прижимая
кусочек ткани поверхностью разреза.
2. Мазки-отпечатки фиксируют и окрашивают метиленовым
синим или по Граму.
3. При
микроскопии
отмечают
присутствие
микроба-
возбудителя в различных органах и тканях.
38
Занятие № 9
\1ИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ОСНОВЫ ХИМИОТЕРАПИИ
БАКТЕРИАЛЬНЫХ ИНФЕКЦИЙ
Методы изучения чувствительности бактерий к антибиотикам
Практические навыки, приобретаемые на занятии
1. Метод
дисков
для
определения
устойчивости
(и
чувствительности) бактериальной культуры к антибиотикам
(проведение и учёт).
2. Метод серийных разведений для определения устойчивости
(и
чувствительности)
бактериальной
культуры
к
антибиотикам (алгоритм проведения, вычисление МИК и
МБК).
Метод дисков для определения устойчивости бактериальной
культуры к антибиотикам (проведение и учёт)
1. Бумажные
диски,
пропитанные
определенными
антибиотиками, помещают на поверхность мясо-пептонного
агара в чашках Петри, предварительно засеянных «газоном»
исследуемой бактериальной культуры.
2. Посевы инкубируют в течение 16—24 ч, после чего учитывают
результаты опыта по образованию прозрачных зон - зон
задержки роста бактерий вокруг дисков. По диаметру этих зон
ориентировочно
судят
о
чувствительности
бактерий
к
антибиотикам, а при отсутствии зоны задержки роста - об их
полной устойчивости.
3. Так, например, появление зоны задержки роста диаметром до
15 мм указывает на слабую, с диаметром до 25 мм на среднюю,
а более 25 мм — на сравнительно высокую чувствительность
исследуемого микроорганизма к соответствующему анти
биотику.
39
Рис.19.
Метод дисков для изучения устойчивости
(либо чувствительности) бактерий к антибиотикам
Метод серийных разведений для определения устойчивости
бактериальной культуры к антибиотикам (алгоритм
проведения, вычисление МИК и МБК)
Данный
метод
считается
наиболее
точным
для
количественного
определения чувствительности бактерий к
антибиотикам.
1. Основной, исходный раствор антибиотика, содержащий,
например, 100 мкг/мл, готовят с помощью буферного
раствора или специального растворителя.
2. Серийные разведения препарата (двукратные -
1:200 1:400
1:800 1:1600 1:3200)
готовят в пробирках, содержащих 1
мл мясопептонного бульона, следующим образом:
a. в 1-ю пробирку вносят 1 мл исходного раствора
препарата, перемешивают с МПБ;
b
. 1 мл смеси антибиотика и МПБ из 1-й пробирки
переносят в следующую пробирку, в которой уже
содержится 1 мл МПБ, и т.д. - таким методом делают
серию (ряд) последовательных разведений препарата от
50 до 3.12 мкг/мл в равных объемах питательной
среды.
3. Затем в каждую пробирку вносят 0,1 мл испытуемой
бактериальной суспензии
с
густотой
1
млрд/мл
по
оптическому стандарту.
40
4. Одновременно ставят
2 контроля: контроль бактерий
(1 мл мясопептонного бульона+ +0,1 мл суспензии бактерий)
и
контроль антибиотика
(1 мл мясопептонного бульона +
антибиотик).
5. Посевы инкубируют, после чего отмечают результаты.
Отсутствие помутнения среды свидетельствует о задержке
роста бактерий в присутствии данной концентрации
препарата.
Бактериостатической
дозой,
или
минимальной
ингибирующей концентрацией (МИК),
называется наименьшая
концентрация антибиотика, в присутствии которой угнетается
нндимый рост бактерий.
Таблица 1 - Определение чувствительности бактериальной
культуры к антибиотику методом серийных разведений: «-» -
отсутствие роста, «+» - наличие роста. МИК - 12.5 мкг/мл
№
юбирки
Разведение
антибиотика
Концентрация
антибиотика,
мгк/мл
Исследуемая
культура,
мл
Рост бактерий
(помутнение
среды)
1
1:100
100
0,1
_
2
1:200
50
0,1
_
3
1:400
25
0,1
_
4
1:800
12,5
0,1
_
5
1:1600
6,25
0,1
+
6
1:3200
3,12
0,1
+
7
1 мл бульона без антибиотика
0,1
+
(контроль)
Для определения
бактерицидного действия
препарата до
полнительно производят высевы из пробирок, в которых от
сутствует видимый рост бактерий, на чашки Петри с плотной
питательной средой, не содержащей антибиотик.
Наименьшая
концентрация
антибиотика,
вызывающая
нолную гибель испытуемых бактерий, о чем свидетельствует
отсутствие
роста
на агаре
без
антибиотика,
называется
минимальной бактерицидной концентрацией (МБК).
41
ИТОГОВОЕ ЗАНЯТИЕ ПО ОБЩЕЙ МИКРОБИОЛОГИИ
Занятие № 10
Перечень практических навыков по общей микробиологии
1. Приготовление мазка из культуры, выросшей на плотной
питательной среде.
2. Приготовление мазка из культуры, выросшей на жидкой
питательной среде.
3. Окраска мазка метиленовым синим.
4. Окраска мазка водным фуксином.
5. Микроскопия
мазка с
использованием
иммерсионной
системы.
6. Окраска мазка по Граму.
7. Идентификация по мазку стафилококка.
8. Идентификация по мазку стрептококка.
9. Идентификация по мазку палочковидной бактерии.
Ю.Окраска мазка по Цилю-Нильсену.
11 .Идентификация по мазку бацилл.
12.Идентификация по мазку капсульных бактерий.
13.Идентификация по мазку стрептомицетов.
14.Идентификация
по
мазку
плесневой
формы
микроскопического грибка.
15.Идентификация по мазку дрожжей и дрожжеподобных
грибков.
16.Окраска мазка по Нейссеру.
17.Идентификация по мазку коринебактерий (окрашенные по
Нейссеру или по Леффлеру).
18.Засев патологического материала на пластинчатый МПА
петлей с целью получения отдельных колоний.
19.Индикация типа колоний (S- или R-) на пластинчатом МПА.
20.Пересев части колонии на скошенный МПА.
21.Пересев бактериальной культуры со скошенного МПА на
среду Гисса.
22.Расчёт концентрации бактериофага по методу Грациа.
23.Обнаружение бактерий в препарате «раздавленная капля».
24.0пределение вирулентности бактериальной культуры по
косвенным признакам (наличие гемолитической активности,
наличие
лецитиназной
активности,
наличие
42
плазмокоагулазной активности).
25.Метод дисков для определения устойчивости бактериальной
культуры к антибиотикам (проведение и учёт).
26.Метод серийных разведений для определения устойчивости
бактериальной
культуры
к
антибиотикам
(алгоритм
проведения, вычисление МИК и МБК).
И М М У Н О Л О Г И Я
Занятие № 1 1
ИММУНОЛОГИЯ КАК НАУКА. ЕСТЕСТВЕННЫЙ
ИММУНИТЕТ
Оценка функционального состояния фагоцитов
Практические навыки, приобрет аемые на занятии
1. Определение титра лизоцима в слюне (алгоритм проведения
и оценка результата).
2. Вычисление фагоцитарного числа и фагоцитарного индекса
в готовых препаратах, окрашенных по Романовскому-Гимзе.
Определение титра лизоцима в слюне
(алгоритм проведения и оценка результата)
1. Готовят серийные разведения препарата слюны (двукратные
-
1:2
1:4
1:8
1:16
1:32
1:64
1
:
128
)
в пробирках,
содержащих 1 мл мясопептонного бульона, следующим
образом:
a. в 1-ю пробирку вносят 1 мл исходного раствора
препарата слюны, перемешивают с МПБ;
b
. 1 мл смеси слюны и МПБ из 1-й пробирки переносят в
следующую пробирку, в которой уже содержится 1 мл
МПБ, и т.д. - таким методом делают серию (ряд)
последовательных разведений препарата в равных
объемах питательной среды.
2. Затем в каждую пробирку вносят 0,1 мл испытуемой
бактериальной суспензии, с густотой
1
млрд/мл по
оптическому стандарту.
3. Одновременно ставят
2 контроля: контроль бактерий
(1 мл мясопептонного бульона +0,1 мл суспензии бактерий)
43
и
кон троль
препарата,
содержащ его
слюну
(мясопептонный бульон + слюна).
4. Посевы инкубируют в термостате, после чего отмечают
результаты. Отсутствие помутнения среды свидетельствует
о лизисе бактерий в присутствии лизоцима, содержащегося в
данном разведении препарата слюны.
5. Титр лизоцима вычисляют по наибольшему разведению, в
котором наблюдается полный дизис бактерий - полное
просветление
среды.
При
этом
степень
мутности
определяют с использованием фотоэлектроколориметра,
либо нефелометрическим методом.
Вычисление фагоцитарного числа и ф агоцитарного индекса в
готовых препаратах, окраш енны х по Ром ановском у-Гимзе
Для постановки пробы в пробирку вносят в соотношении 1:
2; 3 стерильный раствор 2% цитрата натрия, свежую кровь и
взвесь бактерий, содержащую 1 млрд/мл клеток, предварительно
убитых нагреванием при 80°С в течение часа. Содержимое
пробирки перемешивают, инкубируют 30 минут при 37°С,
готовят мазки, которые окрашивают по Романовскому - Гимзе.
Мазки микроскопируют с иммерсией, подсчитывая следующие
фагоцитарные показатели:
•
фагоцитарное
число.
подсчитывают
число
профагоцитировавших нейтрофилов крови (лейкоциты,
содержащие захваченные ими бактерии) из общего числа
фагоцитов
(для
получения
достоверных
результатов
количество их должно быть не менее 100), находящихся в
поле
зрения
микроскопа
(профагоцитировавших
и
непрофагоцитировавших),
и
выражают
полученный
результат в процентах;
■
фагоцитарный
индекс
-
среднее
число
бактерий,
поглощенных одним фагоцитом; для его вычисления
подсчитывают количество фагоцитированных бактерий,
содержащихся в как минимум
100 нейтрофилах, и
вычисляют индекс путем деления общего количества
поглощенных бактерий на общее число подсчитанных
нейтрофилов.
44
Для оценки иммунного фагоцитоза используют показатели
опсоно-фагоцитарной пробы.
В данном случае в пробирку для постановки пробы кроме
2% цитрата натрия, свежей крови и взвеси бактерий добавляют
еще и иммунную (опсонизирующую) сыворотку, содержащую
антитела к бактериям, используемым для постановки теста.
11олученные результаты позволяют оценить функциональную
активность фагоцитов пациента, а также опсонизирующую
активность сыворотки больного.
Опсоно-фагоцитарный показатель (ОФП) или индекс -
)то отношение фагоцитарного индекса, полученного с иммунной
сывороткой,
к
фагоцитарному
индексу,
полученному
в
присутствии неиммунной сыворотки.
Микроскопируя
мазок,
приготовленный
из
опсонофагоцитарной пробы, и подсчитывая число нейтрофилов,
содержащих различное количество фагоцитированных бактерий
(включая
и
непрофагоцитировавшие
нейтрофилы),
можно
оценивать
опсоно-фагоцитарную реакцию
(по ОФП) по
следующей формуле,:
ОФП = За + 2 Ь + Ic + Od
а
-
число
нейтрофилов,
захвативших
более
41
бактериальной клетки;
Ь - число нейтрофилов, захвативших от 21 до 41
бактериальной клетки;
с - число нейтрофилов, захвативших от
1
до 20
бактериальных клеток;
d - число нейтрофилов, не захвативших ни одной
бактериальной клетки.
Максимально возможный ОФП в данном случае составит
75. Показатель от 50 до 75 характеризует резко положительную
реакцию, 25—49 — выраженную и 10-24 - слабоположительную
реакцию.
Опсоно-фагоцитарную реакцию можно оценивать не только
но формуле, приведенной выше, но и заполняя следующую
таблицу.
45
Таблица 2 - Схема определения показателя опсоно-фагоцитарной
реакции
Количество
фагоцитированных
бактерий в одном
лейкоците
О
1 - 2 0
2 1 - 4 0
41 и более
Оценка
фагоцитоза
О
+
++
Количество
лейкоцитов
2
5
4
14
Вычисление
показателя оценки
опсоно-
фагоцитарной
_____ реакции_____
2x0=0
5x1=5
4x2=8
14x3=42
Итого:0+5+8+42=55
Данный пример оценки опсоно-фагоцитарной реакции
характеризует ее как резко положительную. У здоровых людей (в
сыворотке крови отсутствуют антитела - опсонины) этот
показатель обычно не превышает 1-3.
Для оценки степени завершенного фагоцитоза применяют
показатель
завершенности
фагоцитоза.
Его
определяют
количеством клеток с завершенным фагоцитозом на 100
фагоцитировавших нейтрофильных лейкоцитов.
О завершенности фагоцитоза судят по отсутствию роста на
питательной среде, а при микроскопических исследованиях - по
значительному
уменьшению
размеров
фагоцитированных
бактерий и их фрагментации.
Более достоверные данные о завершенном фагоцитозе
можно
получить,
используя
метод
подращивания
лейкоцитарно-бактериальной взвеси.
Для этого смесь крови в лимоннокислом натрии с тест-
бактериями после инкубации при температуре 37°С в течение 30
мин. распределяют по поверхности чашки Петри с МПА. Затем
чашки Петри помещают в термостат на 2 часа. За это время
подрашивания оставшиеся жизнеспособными бактерии образуют
гигантские формы, которые легко отличаются от погибших.
46
Занятие № 12
ИММУННАЯ СИСТЕМА ОРГАНИЗМА ЧЕЛОВЕКА
Определение активности системы комплемента
Практический навык, осваиваемый студентами на занятии
1. Определение активности системы комплемента (алгоритм
проведения и оценка результата).
Определение активности системы комплемента (алгоритм
проведения и оценка результата)
Обычно для постановки РСК используют комплемент,
|||>гделенный из крови морской свинки. Титрование (определение
концентрации) комплемента проводят в связи с тем, что
содержание его у каждой морской свинки различно.
Для этого основной (исходный) раствор комплемента
(разведенный 1:10) разливают в ряд пробирок от 0,05 до 0,5 мл и
и каждую из них прибавляют 0,85% раствор натрия хлорида,
доводя объем жидкости до 1,5 мл. Затем во все пробирки
добавляют в одинаковом объеме
гемолитическую систему
(смешанные в равных объемах гемолитическая сыворотка в
|'ройном титре и 3% взвесь эритроцитов барана).
Пробирки инкубируют в термостате 30 мин. и затем
определяют титр
комплемента:
наименьшая
концентрация
комплемента
(самое
высокое
разведение),
вызывающая
выраженный гемолиз: в пробирке появляется в результате
гемолиза прозрачная гемолизированная кровь яркого алого цвета
-
«лаковая» кровь.
Занятие № 1 3
КЛЕТОЧНЫЙ ИММУННЫЙ ОТВЕТ. АНТИГЕНЫ
Пластинчатая реакция агглютинации
Практические навыки, приобретаемые на занятии
I. Постановка и учет пластинчатой реакции агглютинации (РА)
на стекле.
47