Файл: Методичка по мікробіології.doc

Рахункова камера Горяєва являє собою товсте предметне скло з нанесеними на ньому поперечними прорізами, що утворюють три поперечно розташовані плоскі площадки (рис. 8.2). Середня площадка подовжнім прорізом розділена навпіл, причому на кожній половині нанесена квадратна сітка. Дві бічні площадки розташовано на 0,1 мм вище за середню. Ці площадки служать для притирання покривного скла. Сітка розділена на визначене число згрупованих великих і маленьких квадратів.

Постійною величиною у всіх сітках є маленький квадрат, сторона якого дорівнює 1/20 мм, площа його 1/400 мм², а об’єм при висоті камери 1/10 мм – 1/4000 мм³ чи 1/4000000 мл. Так званий великий квадрат складається з 16 малих квадратиків.

Камера Горяєва має площу 9 мм², об’єм камери – 9 мм³ і розбита на 225 великих квадратів (15 рядів по 15 великих квадратів у кожнім ряду).

В

Рис. 8.2. Рахункова камера Горяєва:

А – вид зверху; Б – вид збоку; В – вид камери Горяєва з малим збільшенням мікроскопа.

Підрахунок кліток у камері починають через 3–5 хвилин після заповнення її, коли клітини осіли й розташувалися в одній площині. Підрахунок кліток ведуть звичайно в 10 великих або в 20 малих квадратах, переміщаючи її за діагоналлю. З вихідної суспензії варто приготувати 3–4 кратні розведення.

Порядок виконання роботи

1. Виконати посів за методом Коха суспензії зі зразка ґрунту, що розведений в 1000, 10000 раз на тверде вівсяне живильне середовище, МПА і середовище Гаузе. Результати інокуляції й підрахунок мікроорганізмів зробити на наступному занятті:

• наважку підготовленого ґрунту (1 г) поміщають у чисту ступку з невеликою кількістю стерильної води і розтирають гумовою маточкою чи пальцем у гумовій рукавичці приблизно 5 хвилин. Підготовлену суспензію переносять у колбу з 100 мл стерильної водопровідної води. Готують розведення ґрунтової суспензії, для чого 1 мл суспензії переносять послідовно в ряд пробірок з 9 мл стерильної водопровідної води;

• на поверхню твердого й підсушеного середовища наносять краплю ґрунтової суспензії визначеного розведення й за допомогою стерильного скляного шпателя розподіляють по всьому агару. Якщо висів проводять, починаючи з великих розведень, то використовують нову стерильну піпетку і новий шпатель для кожного розведення;

• засіяні чашки Петрі перевертають нагору дном і поміщають у термостат із визначеною температурою, яка сприятлива для розвитку мікроорганізмів, що враховуються;

• підрахунок колоній, що виросли, проводять через визначений час після посіву (3–5 доби). На МПА звичайно на 2–3 добу інкубації враховують спорові й безспорові форми бактерій. На середовищі Гаузе на 5–7 добу враховують колонії актиноміцетів, на сусло-агарі на 5–7 добу – колонії грибів і дріжджів;

• колонії, як правило, рахують, не відкриваючи чашки Петрі, у прохідному світлі. Для зручності дно чашки поділяють на сектори, підраховують кількість колоній у кожнім секторі, кожну відлічену колонію позначають крапкою (маркером) із нижньої сторони чашки Петрі й результати підсумовують. Для підрахунку колоній зручно користатися спеціальним приладом із лічильником;

• точність методу залежить від числа підрахованих колоній: кращим розведенням вважають те, у висіві якого на твердому живильному середовищі виростає від 50 до 150 колоній;

• підрахувавши кількість колоній на всіх паралельних чашках, обчислюють їхнє середнє число на одній чашці і потім роблять перерахування для визначення вмісту мікроорганізмів в 1 г ґрунту за формулою:

(8.1)

де N – кількість клітин у 1 г ґрунту; a – середня кількість колоній на чашці; b – розведення, із якого зроблено посів; c – кількість крапель у 1 мл суспензії.

2. Приготувати препарат із добової культури дріжджів роду Saccharomyces

і підрахувати кількість клітин у вихідній суспензії:

• мікробіологічною петлею краплю суспензії дріжджів наносять у центр рахункової камери. Рахункову камеру покривають покривним склом, ретельно притираючи його з країв до утворення ньютонівських кілець (кольорових смуг);

• підрахунок клітин дріжджів робити (із збільшенням мікроскопа: окуляр 10–15х, об'єктив 20–40х) у 20 малих квадратах, у 3–4 пробах досліджуваної суспензії. Загальне число підрахованих клітин мікроорганізмів повинне бути не менш 600, тому беруть 3–4 проби з досліджуваної суспензії для монтажу камери;

• потім розраховують середнє число мікробних клітин в одному малому квадраті і роблять перерахування на вміст у 1 мл вихідної суспензії за формулою:

(8. 2)

де N – число клітин у 1 мл суспензії; а – середнє число клітин у малому квадраті сітки; h – глибина камери в мм, s – площа малого квадрата сітки в мм ²; n – розведення вихідної суспензії; 1000 – коефіцієнт перерахування мм³ у мл.

3. Провести дослідження мікрофлори повітря методом Коха. Цей метод заснований на седиментації, зв'язаний з осіданням бактеріальних клітин під впливом сили ваги на поверхню агару відкритої чашки Петрі. Він дає представлення в основному про якісний зміст мікроорганізмів. У залежності від поставленої задачі з дослідження мікрофлори повітря може проводитися як визначення загальної бактеріальної зараженості повітря, так і вивчення вмісту санітарно-показових мікроорганізмів, а також наявності патогенних і умовно-патогенних мікроорганізмів.

Для вивчення мікрофлори повітря зробити посів із повітря на МПА й СА живильні середовища у чашки Петрі.

Загальну кількість бактерій, що зустрічаються в повітрі, вираховують за ростом колоній мезофільних мікроорганізмів на МПА, проби відбирають на рівні подиху сидячої людини.

Чашки з МПА експонують 5–10–15 хвилин у залежності від передбачуваного бактеріального забруднення. Орієнтовно відповідно до перерахунку за Омелянським на поверхню 100 см² агару осідає за 5 хвилин така кількість бактерій, що міститься в 10 л повітря.

Результати всіх посівів розглянути на наступному занятті, та проаналізувати кількісний і якісний склад мікрофлори повітря з різних місць забору.

Лабораторна робота № 9

Тема: Дослідження культуральних властивостей мікроорганізмів. Перевірка чистоти культур

Мета: визначити характер росту мікроорганізмів на твердому живильному середовищі; описати отримані колонії мікроорганізмів, що засіяні на попередньому занятті; провести мікроскопічне дослідження мазків різних колоній, забарвлених за Грамом

Матеріали й устаткування: колонії мікроорганізмів на твердих середовищах у чашках Петрі, мікробіологічні пробірки зі стерильним скошеним сусло-агаровим середовищем, МПА, вівсяним агаром, спиртівка (брикети сухого пального), мікробіологічна петля, мікроскоп МБР, предметні і покривні стекла, барвники для фарбування за Грамом – генціанвіолет, фуксин, розчин Люголя, 96 % -ний спирт, пробірки, поплавці, (трубочки діаметром 5–7 мм, довжиною 35–45 мм, запаяні з одного кінця), ваги, пептон, К₂НРО₄, агар, індикатор бромкризолпурпур чи бромтимолблау (1,6 % -ний спиртовий розчин), вуглеводи (глюкоза, лактоза, маніт, сахароза й ін.)

Теоретичні положення

До культуральних, чи макроморфологічних, властивостей відносяться характерні риси росту мікроорганізмів на твердому й рідкому живильному середовищах. На поверхні твердих живильних середовищ мікроорганізми можуть рости у вигляді характерних колоній, чи штрихів суцільного газону. Колонією називають ізольоване скупчення клітин одного виду, що виросло в більшості випадків з однієї клітини. У залежності від того, де росте мікроорганізм (на поверхні густого живильного середовища, в товщі її чи на дні судини), розрізняють поверхневі, глибинні і донні колонії. Колонії, що виросли на поверхні середовища, відрізняються великою різноманітністю і є найбільш істотною особливістю росту багатьох мікроорганізмів на твердому субстраті. В описі колоній враховують наступні ознаки: форму, профіль, край, структуру, розмір, поверхню, колір колонії. Культуральні властивості є діагностичними для ідентифікації мікроорганізмів.

Чистота культури мікроорганізмів повинна бути ретельно перевірена. Це здійснюється, як правило, декількома способами – візуальним (дослідження колоній), мікроскопічним контролем і висівом на ряд живильних середовищ.

Звичайно колонії з клітин чистої культури, що висіяна на густе середовище, схожі одна на іншу, що є доказом чистоти культури (але є виключення, наприклад, у випадку дисоціації колоній на гладкі (S -) і складчасті (R - форми).

Інший критерій чистоти культури – це морфологія клітин. Для чистої культури характерний високий ступінь морфологічної подібності клітин у забарвлених препаратах. Однак бувають виключення у залежності від віку культури, використовуваного середовища й інших умов росту.

Порядок виконання роботи

1. Переглянути колонії на чашках Петрі. Колонії, що виросли на твердому живильному середовищі, проглянути спочатку неозброєним оком чи через лупу. Потім помістити чашки на столик мікроскопа нагору дном і вивчити колонії у прохідному світлі з об'єктивом 8х. Відзначити, описати й замалювати переважні форми (3–5 видів), вибираючи ізольовані колонії. Опис колоній проводять за схемою, що наведена нижче.

В описі колоній враховують наступні ознаки:

Форму колонії (рис. 9.1) – округла, амебоподібна, ризоїдна і т.д.

Рис. 9.1. Форма колоній:

1 – кругла; 2 – кругла з фестончастим краєм; 3 – кругла з валиком; 4 і 5 – ризоїдні; 6 – із ризоїдним краєм; 7 – амебоподібна; 8 – нитковидна; 9 – складчаста; 10 – неправильна; 11 – концентрична; 12 – складна.

Структура колонії (рис. 9.2) – однорідна, дрібно- чи грубозерниста і т.д.

Рис. 9.2. Структура колоній:

1 – однорідна; 2 – дрібнозерниста; 3 – грубозерниста; 4 - струминна; 5 – волокниста.

Розмір (діаметр) колонії вимірюють у мм; якщо розміри колонії не перевищує 1 мм, то їх називають крапковими.

Оптичні властивості (блиск і прозорість) колонії – блискуча, матова, тьмяна, борошниста, прозора, напівпрозора, непрозора, флуоресціююча.

Колір колонії – безбарвна (грязно-білі колонії відносять до безбарвних) чи пігментована – біла, жовта, золотава, жовтогаряча, бузкова, червона, чорна і т.д. В описі колоній актиноміцетів відзначають пігментацію повітряного і субстратного міцелію. Особливо відзначають виділення пігменту в субстрат.

Поверхня колонії – гладка, шорсткувата, борозниста (горбиста), складчаста, зморшкувата, із концентричними колами чи радіально покреслена.

Профіль колонії (рис. 9.3) – плоский, опуклий, кратероподібний, конусоподібний.

Край колонії (рис. 9.4) – рівний, хвилястий, зубцюватий і т.д.

Рис. 9.3. Профіль колонії:

1 – вигнутий; 2 – кратероподібний; 3 – горбистий; 4 – колонія, що вростає у субстрат; 5 – плоский; 6 – опуклий; 7 – краплеподібний; 8 –конусоподібний.

Рис. 9.4. Край колонії:

1 – гладкий; 2 – хвилястий; 3 – зубцюватий; 4 - лопатевий; 5 – неправильний; 6 – війчастий; 7 – нитчастий; 8 – ворсинчастий; 9 – гіллястий.

Консистенцію колонії визначають, доторкаючись до її поверхні петлею. Колонія може легко зніматися з агару, бути густою, м'якою чи такою, що вросла в агар, слизуватою (прилипати до петлі), тягучою, плівчастою (знімається цілком), тендітною (легко ламається за умов дотику петлею).

Край і структуру колонії визначають із невеликим збільшенням мікроскопа. Для цього чашку поміщають на столик мікроскопа кришкою вниз. Консистенцію визначають під час відсівання колоній, доторкаючись до поверхні петлею.

Розміри й деякі інші особливості колоній змінюються з віком і залежать від складу середовища, тому в їхньому описі указують вік культури, склад середовища й температуру культивування.

Здатність до емульгування – рівномірна чи зерниста суспензія у воді, слабко чи зовсім не суспендується у воді.

2. Після опису колонії піддаються мікроскопічному дослідженню. З кожної групи колоній, що виросли на чашках Петрі для вивчення морфології і тинкторіальних властивостей мікроорганізмів повітря приготувати препарати «роздавлена крапля», виконати мазки й забарвити за Грамом. Препарати переглянути з об'єктивами 40х і 90х, відзначити форму й сполучення клітин, наявність чи відсутність спор, визначити, до яких морфологічних груп мікроорганізмів вони відносяться. Мікроскопічну картину замалювати.

3. Зробити підрахунок колоній, що виросли з посівів різних проб мікрофлори повітря і за результатами підрахунку визначити чисельність мікроорганізмів.

Оформити протокол роботи.

Лабораторна робота № 10

Тема: Антибіотики й антагонізм

Мета: вивчити антибіотичні властивості мікроорганізмів, спектр антагоністичної дії

Матеріали й устаткування: культури мікроорганізмів (Streptomyces recifencis, Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Bacillus subtilis, Bacillus mesentericus, Bacillus cereus, Sarcina flava, Saccharomyces cereviceae і ін.), чашки Петрі з МПА, стерильні диски антибіотиків, бактеріологічна петля, пінцет, стерильні ватні тампони, стерильна водопровідна вода

Теоретичні положення

На мікроорганізми діють не тільки абіотичні фактори навколишнього середовища, але й інші мікроорганізми, що живуть в однім і тім же середовищі. Взаємини між ними можуть бути різними: метабіоз, паразитизм, симбіоз, антагонізм. У випадку антагоністичних відносин мікроорганізми виділяють у навколишнє середовище продукти обміну речовин, що можуть або гнітити ріст інших мікроорганізмів, або убивати їх.

Антибіотики – це специфічні продукти життєдіяльності мікроорганізмів, що мають високу фізіологічну активність стосовно визначених груп мікроорганізмів, затримуючи або цілком придушуючи їхній ріст.

Антибіотичні речовини – різноманітні за складом і механізмом дії; кожен антибіотик виявляє біологічний вплив лише стосовно визначених організмів чи груп організмів, не впливаючи на інші.

Утворення антибіотиків – це спадково закріплена особливість метаболізму організмів, специфічна особливість виду мікроорганізмів, що виникла в результаті еволюційного розвитку як одна з пристосувальних особливостей, що обумовлює прояв широко розповсюджених у світі мікроорганізмів антагоністичних відносин.

До синтезу антибіотиків, головним чином, здатні гриби з роду Penicillium, актиноміцети і деякі групи бактерій. Процес утворення антибіотиків тісно пов'язаний з розвитком організмів – продуцентів і здійснюється, як правило, у фазу уповільненого росту.

Для визначення спектра антимікробної дії антибіотика чи чутливості мікроорганізму до антибіотиків використовуються методи, пов'язані зі здатністю антибіотика дифундувати в товщу субстрату.

Порядок виконання роботи

1. Визначити антибіотичну активність мікроорганізмів (наприклад, актиноміцетів) методом перпендикулярних штрихів чи методом агарових блоків.

У першому випадку продуцент і тест-організми вирощують на одному середовищі, у другому – на різних, тому що не завжди те саме середовище однаково сприятливе як для розвитку продуцента й утворення їм антибіотика, так і для росту тест-культур.

На живильний агар у чашці Петрі висівають штрихом передбачуваний продуцент антибіотичної речовини. Посів штрихом роблять вздовж діаметра чашки. Під час посіву чашки тримають агаровою пластиною вниз (щоб спори не розлетілися). Після того, як продуцент виросте (через 5–7 днів) і утворить антибіотичну речовину, що дифундує в товщу агару, перпендикулярно до його штриха підсівають штрихами тест-організми (Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Bacillus subtilis, Bacillus cereus чи ін.), починаючи від периферії чашки. Для посіву використовують густі суспензії у стерильній водопровідній воді. Чашки інкубують при 28–30С упродовж 2–8 діб у залежності від швидкості росту тест-організмів.