Файл: Методичка по мікробіології.doc

Препарат «відбиток». Ці препарати є зручними для вивчення природного розташування клітин у колонії мікроорганізмів й особливо для дослідження форми спор і спороносців актиноміцетів і грибів.

З агаризованої пластинки, на якій мікроорганізми виросли суцільним газоном, вирізають скальпелем невеликий блок і переносять на предметне скло так, щоб поверхня з мікроорганізмами була обернена нагору. Потім до газону прикладають чисте покривне скло і негайно знімають, намагаючись не зрушити убік. Отриманий препарат поміщають відбитком униз у краплю води (можна в краплю метиленового синього) на предметне скло і розглядають під мікроскопом із сухою системою. Такий відбиток можна одержати і на предметному склі, якщо торкнутися ним поверхні колонії. Відбитки можна фіксувати й забарвлювати будь-яким способом.

Дослідження фіксованих забарвлених препаратів – найбільш розповсюджений мікробіологічний метод для виявлення морфологічних особливостей, кількісного обліку мікроорганізмів, а також для перевірки чистоти культури. Фіксовані забарвлені препарати можуть зберігатися тривалий час і розглядаються з імерсійною системою. Їхнє готування включає наступні етапи: виконання мазка, висушування, фіксацію й забарвлення.

У простому забарвленні мікроорганізмів застосовують якийсь один з основних анілінових барвників: метиленовий синій, основний фуксин, генціановий фіолетовий, кристалічний фіолетовий. Профарбовується вся клітина.

Готування мазка. За допомогою стерильної бактеріологічної петлі чи піпетки нанести на знежирене предметне скло краплю суспензії мікроорганізму. Матеріал із густого живильного середовища узяти бактеріологічною петлею і внести його в краплю стерильної водопровідної води. Матеріал рівномірно тонким шаром розподілити на площі 1–2 см².

Висушування мазка. Висушити приготовлений мазок при кімнатній температурі у повітрі. Тонкий мазок висихає дуже швидко. Якщо висушування мазка уповільнене, препарат можна злегка нагріти в струмені теплого повітря, тримаючи предметне скло високо над полум'ям пальника мазком нагору. Цю операцію проводять дуже обережно, не перегріваючи мазка, інакше клітини мікроорганізмів деформуються.

Фіксація дає можливість швидко перервати протікання життєвих процесів у живому об’єкті, зберігаючи його тонку структуру. Фіксація переслідує кілька цілей: забезпечити прикріплення клітин до скла; зробити мазок більш сприйнятливим до забарвлення, оскільки мертві клітини забарвлюються краще, ніж живі; зробити безпечним подальші маніпуляції з мазком, що важливо в роботі з патогенними мікроорганізмами.

Найпростіший і розповсюджений спосіб фіксації – термічна обробка. Після висушування мазок зафіксувати в полум'ї пальника. Тримаючи скло мазком нагору, тричі провести його через гарячу частину полум'я пальника. Щоб уникнути перегріву, час прямого впливу полум'я не повинний перевищувати 3–4 с. Крім жару фіксацію можна робити хімічними речовинами, для цього використовують 96 %-ний етиловий спирт (час фіксації 5–10 хвилин), суміш Нікіфорова (спирт : ефір – 1 : 1; час фіксації 10–15 хвилин); ацетон (5 хвилин) та ін.

Забарвлення. Фіксований препарат помістити мазком нагору на місток із двох паралельних скляних паличок, з'єднаних гумовими трубками, що знаходяться на стінках кювети чи кристалізатора. Нанести на нього 2–3 краплі барвника (кінець піпетки не повинний торкатися мазка!) на 2–3 хвилини. Під час фарбування розчин барвника на мазку не повинний підсихати, при необхідності доливати нові порції. Для одержання більш чистих препаратів барвник наливають на мазок, покритий фільтрувальним папером. По закінченні фарбування препарат промивають водою доти, поки стікаюча вода не стане безбарвною. Потім препарат висушують у повітрі і промокають фільтрувальним папером.

Існують прості і диференційовані методи забарвлення. При простому забарвленні використовують один який-небудь барвник, наприклад метиленовий синій, фуксин, генціанфіолетовий в лужних або карболових розчинах. При цьому фарбується вся клітина. При диференційованому забарвленні різними барвниками забарвлюються тільки окремі структури клітини. Наприклад – метод забарвлення за Грамом, забарвлення спор, джгутиків, нуклеоїду та ін.

Барвники за хімічною природою розподіляються на кислі та лужні. Їх також поділяють на позитивні й негативні. З барвників, які застосовуються в мікробіологічній практиці, більшість відноситься до позитивних. Вони забарвлюють всю клітину при кімнатній температурі протягом 30–60 с. Негативні барвники забарвлюють проміжки, які оточують клітини мікроорганізмів. В результаті клітини виглядають силуетами на фоні барвника.

Правила роботи з імерсійним об'єктивом. Після установлення освітлення приготовлений сухий пофарбований препарат спочатку розглядають із невеликим збільшенням під об'єктивом сухої системи (8х, 40х). Знайшовши найбільш удале місце на ньому, препарат закріплюють затисками на столику мікроскопа. Тубус мікроскопа піднімають і, повертаючи револьвер, установлюють імерсійний об'єктив. Потім у центр препарату на мазок, не знімаючи зі столика мікроскопа, наносять краплю імерсійної (кедрової) олії і, дивлячись збоку, обережно опускають тубус мікроскопа до занурення об'єктива в олію. Стежать за тим, щоб фронтальна лінза не торкнулася предметного скла і не одержала ушкодження. Після цього, дивлячись в окуляр, макрометричним гвинтом повільно піднімають об'єктив до появи в полі зору досліджуваного об'єкта. Фокус уточнюють за допомогою мікрометричного гвинта.

Після роботи кедрову олію негайно видаляють з об'єктива серветкою, що змочена очищеним бензином. Ксилол і спирт використовувати не рекомендується, тому що вони можуть викликати розклеювання лінз об'єктивів.

У правильно забарвленому і добре промитому препараті поле зору залишається світлим і чистим, а пофарбованими залишаються клітини мікроорганізмів.

Порядок виконання роботи

1. Приготувати й провести мікроскопічне дослідження прижиттєвих препаратів мікроорганізмів за методами «висяча» та «роздавлена» краплі.

2. Зробити препарат «відбиток».

3. Приготувати для мікроскопічного дослідження препарати фіксованих забарвлених клітин мікроорганізмів простим способом та виконати мікроскопію з імерсією.

4. Вивчити препарати. Результати занести до зошита у вигляді малюнка. Зробити висновки.

5. Препарати, перш ніж вимити, поміщають у судину з дезінфікуючим розчином.

Лабораторна робота № 3

Тема: Морфологія бактерій і актиноміцетів

Мета: вивчити морфологічну різноманітність прокаріотичних організмів (бактерій і актиноміцетів)

Матеріали й устаткування: природні субстрати (кисляк, кефір, настій сіна, біогумусу, розсіл квашеної капусти, гниле м'ясо й ін.) і постійні препарати з культур мікроорганізмів різних морфологічних груп (Streptococcus lactis, Micrococcus lisodeikticus, Lactobacillus acidophylum, Streptomyces recifensis, Lactobacterium plantarum й ін.), культури актиноміцетів, що виросли на чашках Петрі, мікроскопи МБР, МБД, стерильні піпетки на 1–2 мл, бактеріологічна петля, пінцет, препарувальна голка, тонкі предметні стекла, покривні скельця, у тому числі з лункою, спиртівка (брикети сухого пального), кювета з містком для фіксованих препаратів, крапельниці з фарбами: метиленовий синій (1:40), водний розчин фуксину основного, генціанвіолет, стерильний розчин чорної туші (1:9); імерсійна олія, бензин, серветки, фільтрувальний папір, розчин, що дезінфікує, промивалка з дистильованої водою

Теоретичні положення

Бактерії складають найбільш велику і дуже різноманітну групу (понад 1600 видів) мікроорганізмів. Бактерії – це в основному одноклітинні організми, що розмножуються простим поперечним поділом. Морфологічно бактерії розрізняють за формою, взаємним розташуванням клітин, наявністю чи відсутністю джгутиків і капсул, здатністю клітин до спороутворення і т.п.

За формою бактерії поділяються на кілька груп: сферичні, циліндричні, спіральні, незвичайної форми і нитчасті.

Кулясті (сферичні) бактерії – коки (Coccus). Напрямок площини поділу клітин і характер взаємного розташування клітин використовують як систематичну ознаку для виділення родів сферичних бактерій. Діаметр коків 0,5–1,2 мкм. Кулясті бактерії, як правило, не мають джгутиків, нерухомі і спор не утворюють.

Моно- чи мікрококи (рід Micrococcus). Їхні клітини поділяються в будь-якій площині і відразу після поділу відокремлюються, розташовуючись поодиноко.

Диплококи (рід Diplococcus) і стрептококи (рід Streptococcus) утворюються у поділі клітин в одній площині; у диплококів клітини розташовуються попарно.

Стрептококи (рід Streptococcus) поділяються також в одній площині, але клітини не відокремлюються одна від одної , а утворюють ланцюжка.

Тетракоки (рід Tetracoccus) виникають за умов поділу клітин у двох взаємно перпендикулярних площинах, клітини утворюють групи по 4 особини.

Сарцини (рід Sarcina) формуються у розподілі клітин у трьох взаємно перпендикулярних площинах, при цьому утворюються пакети з 8–12 клітин і більше.

Стафілококи (рід Staphylococcus) представляють скупчення клітин, що нагадують виноградні грона. Поділ клітин відбувається в будь-якій площині.

Крім правильної кулястої форми, клітини можуть мати овальну чи ланцетоподібну форму (пневмококи), чи бобоподібну форму кавового зерна (гонококи, менінгококи).

Паличкоподібні (циліндричні) бактерії – найбільш чисельна та різноманітна група бактерій. Паличкоподібні бактерії розрізняють по величині клітин, їхньому розташуванню, обрису кінців клітини, по наявності чи відсутності джгутиків. Довжина клітин паличкоподібних бактерій коливається від десятих часток мкм до 10–15 мкм і більш, діаметр клітин від 0,5 до 1,0 мкм.

Більшість паличкоподібних мікроорганізмів – форми безспорові, вони називаються бактеріями (Bacterium, позначають Bact., чи B). Паличкоподібні бактерії, які здатні за несприятливих умов формувати спори, прийнято називати бацилами (Bacillus, позначають Bac.). Бактерії й бацили розташовуються поодиноко, чи попарно з'єднуються в ланцюжки, в останньому випадку їх називають відповідно стрептобактерії та стрептобацили. Спори різних бактерій відрізняються за формою, розмірам і положенню в клітині. За умов бацилярного положення спори локалізуються в клітині у центрі, ексцентрально чи термінально і при цьому клітина не змінює свою форму. Під час клостридіального формування спори клітина змінює форму, здобуваючи вид човника чи веретена. Ендоспора розташовується в стовщеній частині клітини центрально чи ексцентрально. Плектридіальне положення – це термінальна локалізація спори. У місці її розташування клітина розширюється й здобуває вид барабанної палички чи ракетки.

Звиті (спіральні) бактерії у залежності від форми й кількості витків поділяють на три типи клітин.

Вібріони (рід Vibrio) представлені короткими вигнутими паличками у формі коми. Клітини вібріонів вигнуті на 1/3–1/4 обороти. Довжина клітин складає 1–3 мкм.

Спірили (рід Spirillum) – клітини, що вигнуті на 2–3 обороту, мають форму латинської букви S. Розміри клітин у порівнянні з вібріонами значно крупніше – 15–20 мкм.

Спірохети (рід Spirochaeta) представлені дуже тонкими довгими клітинами штопороподібної форми з великим числом дрібних витків. Довжина клітин перевищує ширину в 5–200 разів. Число витків спіралі є одним із систематичних ознак для визначення виду.

Міксобактерії (слизисті бактерії). Група бактерій, які стоять на більш високому ступені розвитку, ніж описані вище. У деяких представників міксобактерій (Sorangsum, Poliangium) в світлопольному мікроскопі чітко видно диференційоване ядро. Вегетативні клітини мають паличкоподібну форму з загостреними або округлими кінцями. По мірі старіння вони скорочуються і переходять в мікроспори, які з’єднуються слизом й утворюють первинні або вторинні цисти, з яких в подальшому формуються плодові тіла.

Для спостереження за формою міксобактерій беруть колонії, які розвиваються навколо грудочок ґрунту на гелевих пластинах з клітковиною.

Нитчасті форми бактерій являють собою ланцюжки циліндричних клітин, часто оточені загальним чохлом. Розповсюджені в ґрунті, водоймах, особливо з високим вмістом заліза. Типовим представником нитчастих бактерій є Leptothrix, який відноситься до залізобактерій. Він окислює закисні форми заліза в окисні.

Актиноміцети – променисті грибки, займають проміжне положення між бактеріями й грибами. Вони одноклітинні прокаріотичні клітини, як бактерії, й утворюють гіллястий міцелій з довгими та розгалуженими нитками (гіфами), як у цвілевих грибів.

Актиноміцети відіграють велику роль в процесах ґрунтоутворення і оздоровлення ґрунтів. Вони трансформують і розкладають складні органічні сполуки (клітковину, гумус, хітин, лігнін та ін.). Актиноміцети утворюють специфічні продукти життєдіяльності, а саме антибіотики, ферменти, вітаміни, стимулятори росту.

На поживних середовищах актиноміцети утворюють пухнасті, бархатисті, мучнисті, переважно щільні колонії, які зростаються з субстратом, іноді з характерним запахом ґрунту. Міцелій актиноміцетів диференційований – одна частина занурена в субстрат (субстратний міцелій), інша знаходиться над субстратом (повітряний міцелій). Багато представників актиноміцетів в процесі життєдіяльності продукують пігменти, тому їх повітряний міцелій і особливо колонії забарвлені в сині, голубі, фіолетові, рожеві, бурі, коричневі або чорні кольори. На поверхні колоній виростає повітряний міцелій, на кінцях якого спороносці зі спорами, які служать для нестатевого розмноження. Актиноміцети розмножуються також вегетативно за допомогою шматочків міцелію. Актиноміцети відносяться до аеробів, гетеротрофів, мезофілів, за Грамом – грампозитивні.

Нокардії (проактиноміцети). Це перехідна форма мікроорганізмів, які займають проміжне місце між актиноміцетами та мікобактеріями. Повітряний міцелій у них відсутній або слабо розвинений. На поживних середовищах розвиваються колонії тістоподібної (м’якої) консистенції з характерним міцеліальним краєм. Забарвлення їх також різноманітне, як і в актиноміцетів. У молодому віці нокардії утворюють міцелій, який потім починає септуватися (в нитках утворюються перетинки) і розпадатися на паличкоподібні фрагменти, які в подальшому перетворюються на короткі палички, але частіше в коки. Типовим представником є культура Nocardia rubra, яка на поживних середовищах утворює колонії червоного кольору.

Мікобактерії. Це найбільш низько організовані актиноміцети. Справжнього міцелію не утворюють. Колонії тістоподібної консистенції, продукують пігмент. В молодому віці формують палички викривленої форми з нерівним контуром (зіркоподібні, іноді досить довгі, з боковими відростками). В старих культурах розгалужені палички розпадаються спочатку на більш короткі палички, потім на коки. Гетеротрофи, аероби, грампозитивні.