Файл: Методичка по мікробіології.doc

Бактерії незвичайної форми морфологічно різноманітні – тороїдальні (замкнені та незамкнені кільця), зіркоподібні, тубероідальні (паличкоподібні бактерії зі сферичним роздуттям), червоподібні із загостреними кінцями, стеблові, плоскі у вигляді квадратних пластинок або інших геометричних форм.

Багато представників бактерій – рухливі організми. За характером розташування й числом джгутиків розрізняють монотрихи – бактерії з одним джгутиком на одному з кінців клітини; лофотрихи – бактерії з декількома джгутиками, розташованими на одному з кінців клітини, амфітрихи – бактерії з полярним джгутикуванням на двох кінцях; перитрихи – бактерії з великим числом джгутиків по всій поверхні бактеріальної клітини.

Порядок виконання роботи

1. Для вивчення морфології бактерій заздалегідь приготувати настої різних природних субстратів: м'яса, риби, білка яйця, сіна, борошна, овочів, фруктів та ін. Невелику кількість матеріалу подрібнюють, поміщають у склянку, на кінчику скальпеля додають трохи крейди і заливають водопровідною водою на 2/3 об’єму склянки. Склянку з настоєм витримують у термостаті при температурі 25–28С (чи в теплому приміщенні в темряві 3–5 днів). За цей час у середовищі накопичується маса різноманітних мікроорганізмів.

2. Приготувати та дослідити препарати живих клітин мікроорганізмів із природних субстратів:

• за методом «роздавленої краплі» – із кисломолочних продуктів;

• за методом «висячої краплі» – із гнилого м'яса, риби, настою біогумусу.

В обох випадках можливе забарвлення об'єкта «прижиттєвими» барвниками – вітальне фарбування. Як прижиттєві барвники можна використовувати метиленовий синій, нейтральний червоний у концентраціях від 0,001 до 0,0001 %.

• «препарат-відбиток» одного з представників актиноміцетів.

Оскільки міцелій актиноміцетів дуже тонкий і довгий, то для вивчення природного розташування клітин цих організмів варто приготувати препарати-відбитки. Покривне скло покласти на поверхню колонії, злегка притиснути до одержання чіткого відбитка, зняти за допомогою пінцета і помістити на предметне скло в краплю води відбитком униз. Паралельно приготовлений таким способом відбиток за аналогією з мазком бактерій висушують, фіксують жаром, забарвлюють і виконують мікроскопію, використовуючи об'єктив 90х з імерсією. Відбиток із такого ж способу можна одержати і на предметному склі.

3. Паралельно з рідини настоїв приготувати фіксовані та забарвлені (простим способом) препарати мікроорганізмів. Зробити мікроскопію спочатку із сухим об'єктивом 40х, потім переглянути, використовуючи імерсійну систему (об'єктив 90х).

4. Для вивчення морфології бактерій приготувати препарати з використанням колекції чистих культур різних морфологічних груп. Препарати розглянути з імерсією, відзначити форму й сполучення клітин різних мікроорганізмів.

5. Приготувати фіксований препарат-мазок із зубного нальоту. На предметне скло нанести бактеріологічною петлею краплю стерильного фізіологічного розчину чи водопровідної води, потім обережно знімають зубний наліт сірником, розтирають у краплі води та тонким шаром розподіляють на поверхні чистого знежиреного скла. Мазок підсушують у повітрі, фіксують і зафарблюють, розглядають з імерсією.

6. Приготувати прижиттєві препарати з негативним контрастуванням за допомогою рідкої туші з матеріалу будь-якого настою.

Рідкий препарат. На добре знежирене предметне скло мікробіологічною петлею наносять велику краплю досліджуваної культури мікроорганізмів. Суміш ретельно перемішують і накривають покривним склом. Покривне скло обережно притискають до предметного смужкою фільтрувального паперу. Виконують мікроскопію препарату, користаючись об'єктивом 40х. На темному фоні туші виявляються прозорі зони капсул навколо різко обкреслених клітин.

Висушений препарат. Краплю туші поміщають на добре знежирене предметне скло і змішують із краплею рідини, що містить бактерії. За допомогою покривного скла розподіляють мазок тонким шаром на поверхні предметного скла. Після того, як препарат висохне у повітрі, виконують його мікроскопію, користуючись об'єктивом МІ-90. У полі зору мікроскопа на загальному темному фоні туші чітко видно незабарвлені клітини мікроорганізмів різної форми, різних розмірів, розташовані в різноманітних сполученнях.

7. Усі переглянуті під мікроскопом препарати замалювати. Під кожним малюнком указати назву об'єкта, відзначити морфологічні особливості організмів і збільшення мікроскопа, з яким розглядався препарат.

Лабораторна робота № 4

Тема: Морфологія дріжджів, цвілевих грибів і найпростіших

Мета: ознайомитися з технікою мікроскопічного дослідження, класифікацією та морфологією різних груп еукаріотичних мікроорганізмів

Матеріали й устаткування: добові культури дріжджових грибів, що вирощені на чашках Петрі (Candida tropicalis, Saccharomyces cereviceae), 5–7 добові культури цвілевих грибів (Mucor mucedo, Aspergillus niger, Aspergillus flavus, Penicillum cyclopium, Blakeslea trispora, Oidium lactis), мікроскопи МБР, МБД, бактеріологічна петля, препарувальна голка, пінцет, тонкі предметні стекла, покривні скельця, суміш спирт + гліцерин (1:1) із додаванням метиленового синього, спиртівка (брикети сухого пального), кювета з містком для фіксованих препаратів, крапельниці з фарбами: метиленовий синій (1:40), водний розчин фуксину основного, імерсійна олія, бензин, серветки, фільтрувальний папір, розчин, що дезінфікує, промивалка з дистильованою водою

Теоретичні положення

Гриби – одне з найбільших царств еукаріотичних гетеротрофних організмів, різноманітних за будовою й способом життя. Об'єктами мікробіології є як одноклітинні, так і багатоклітинні мікроскопічні гриби – дріжджі, а також деякі цвілеві гриби.

Дріжджові клітини морфологічно досить різноманітні. Вони бувають округлими, овальними, подовженими та лимоноподібними. Клітини дріжджів значно крупніше бактеріальних і досягають у діаметрі 4–10 мкм. Дріжджові клітини – нерухомі, вони мають клітинну стінку, цитоплазму і ясно виражене диференційне ядро. Багатьом дріжджам властиве утворення великих скупчень різної форми, деякі дріжджі можуть утворювати рудиментарний міцелій.

На густих живильних середовищах дріжджі ростуть у вигляді різних опуклих безбарвних, жовтувато-жовтогарячих, рожевих, коричневих, бежевих колоній м'якої консистенції, що не вростають у субстрат. Форма й колір колоній мають значення для діагностики дріжджів. Більшість дріжджів розмножуються брунькуванням. До дріжджів, що брунькуються, відносяться представники роду Saccharomyces. Ряд дріжджів розмножується поділом (Shizosaccharomyces). Дріжджі, у яких спостерігається статевий процес, зв'язаний зі спороутворенням, називаються справжніми дріжджами і відносяться до аскоміцетів. Аспорогенні дріжджоподібні організми відносяться до недосконалих грибів (Candida, Torulopsis, Endomyces, Oidium та ін.).

Цвілеві гриби поширено повсюдно. Особливо багато їх у ґрунті й у місцях із підвищеною вологістю. Цвілеві гриби мають велике значення як продуценти багатьох цінних речовин – ферментів, антибіотиків, органічних кислот та інших продуктів. За назвою «цвілеві гриби» поєднуються деякі представники зигоміцетів (нижчі гриби), недосконалих і сумчастих грибів (вищі гриби). На густих субстратах цвілі утворюють округлі пухнасті, нитковидні, павутиноподібні, ватоподібні і порошкоподібні колонії зеленого, жовтуватого, чорного чи білого кольору. Колонії цвілій складаються з великої кількості гіллястих ниток, що називаються гіфами. Велика частина гіфів розвивається в повітрі, а частина в товщі субстрату. Система гіфів у цілому утворює міцелій. У порівнянні з розмірами бактерій діаметр ниток більшості цвілій досить великий і коливається від 5 до 50 мкм і більш. Гіфи часто видно неозброєним оком. Міцелій представників зигоміцетів не має поперечних перегородок (септ), міцелій інших плісеней септований. У плісеней мається диференційне ядро, причому міцелій зигоміцетів багатоядерний. У зигоміцетів (Mucor) на вільних кінцях плодоносних гіфів (спорангієфорах) в особливих кулястих тільцях (спорангіях) утворюються ендоспори. У представників аскоміцетів і недосконалих грибів (Aspergillus, Penicillium) конідієспори (конідії) також утворюються на вільних кінцях плодоносних гіфів, але є екзогенними, тому що вони не укладені в спорангій, а формуються на поверхні конідієфора, складаючи іноді довгі ланцюжки на зразок намиста. Плодоносні гіфи розташовуються в повітряному міцелії.

Найпростіші (Protozoa) – це одноклітинні організми, що є найбільш просто організованими представниками царства тварин. Морфологічно найпростіші дуже різноманітні. Розміри клітин найпростіших коливаються в широких межах у залежності від видової приналежності і фізіологічного стану. Більшість найпростіших у сотні разів крупніше багатьох бактерій. До найпростіших відноситься до 15 тисяч видів. З них близько 12 тисяч видів є сапрофітними формами, що живуть у ґрунті та воді, інші – паразитами людини й тварин. Мікробіологи мають справу з обмеженим числом представників, в основному, збудниками різних захворювань людини: дизентерійною амебою, малярійним плазмодієм, окремими видами трипаносом, лейшманіями і деякими іншими.

Порядок виконання роботи

1. Приготувати й виконати мікроскопію клітин дріжджів Saccharomyces cereviceae та дріжджоподібних грибів Candida tropicalis, Oidium lactis у препараті «роздавлена крапля» й провести їхнє прижиттєве забарвлення метиленовим синім у розведенні 1:40. Розглянути клітини дріжджів, що брунькуються й діляться .

Методи виявлення живих і мертвих мікробних клітин засновані на різному прониканні барвника, що характеризується різним фізіологічним станом клітини. Виявлення живих і мертвих клітин грибів проводять на вітальних (прижиттєвих) препаратах за допомогою метиленового синього. Для цього на предметне скло в краплю мікробної суспензії вносять краплю барвника метиленового синього, витримують не більш однієї хвилини, накривають покривним склом, забирають надлишок рідини фільтрувальним папером і виконують мікроскопію у прохідному світлі. Живі клітини, що не пропускають барвник, не забарвлюються, мертві клітини синього кольору.

2. Розглянути колонії грибів Mucor mucedo, Aspergillus niger, Penicillum cyclopium. Колонії грибів розглядають у мікроскоп з об'єктивом 8х безпосередньо у відкритій чашці Петрі.

3. Приготувати препарат «відбиток» одного з представників цвілевих грибів.

4. Приготувати препарат «роздавлена крапля» цвілевих грибів Mucor, Aspergillus, Penicillium і вивчити будову їхніх спорангіїв, конідій і конідієносіїв.

Міцелій грибів погано змочується водою, тому препарат готують у суміші спирту з гліцерином (1:1) чи води з оцтовою кислотою (1:1). Для дослідження грибів на добре знежирене предметне скло наносять краплю суміші. За допомогою двох препарувальних голок у цю краплю обережно переносять шматочок міцелію цвілевого гриба, обережно, не порушуючи структури міцелію, розправляють гіфи та органи, що плодоносять. Перед тим як покласти покривне скло, розглянути препарат із невеликим збільшенням. Потім краплю накривають покривним склом і злегка придавлюють. Дослідження проводять у світловому мікроскопі з використанням об'єктивів 8х і 40х у затемненому полі зору, для чого звужують діафрагму чи опускають конденсор. Для кращої видимості будови міцелію в краплю під покривне скло можна додати невелику кількість фарби (одну краплю фуксину чи метиленової сині). Міцеліальні гриби можуть бути ідентифіковані з характерного спороношення.

У дослідженні культури мукорової цвілі звернути увагу на наявність несептованого міцелію, від якого відходять несептовані спорангієносії з кулястим розширенням угорі (спорангієм), що наповнений ендоспорами.

В аспергілових плісеней гіфи септованого міцелію, переплітаючись один з одним, утворюють густу грибницю, від якої відходять одноклітинні конідієносії, що закінчуються віялоподібним розширенням (стерігми зі спорами – конідії).

У пеніцилових плісеней від грибниці відходять септовані конідієносії, що закінчуються пензликами стеригм і конідій (спори).

5. Використовуючи демонстраційний матеріал, ілюстрації й плакати, вивчити та замалювати деяких представників сапрофітних і паразитарних форм найпростіших.

По закінченні роботи предметні та покривні стекла із препаратами перш, ніж вимити, продезінфікувати. Результати спостережень відобразити у вигляді малюнків. Указати назву об'єкта, відзначити морфологічні особливості організмів.