Файл: мікробіологія.doc

37. Історія відкриття і головні етапи розвитку вірусології. Роль Івановського. Методи визначення вірусів. Методи культивування вірусів та іх оцінка.

Вперше існування вірусу довів в 1892 році Івановський,у результаті спостережень хвороби тютюну, під назвою мозаїчної. Іванівський відкрив віруси - нову форму існування життя.

Етапи розвитку:

Кінець XIX - початок XX-го століття. Основним методом ідентифікації вірусів у цей період був метод фільтрації через бактеріологічні фільтри, які використовувалися як засіб поділу збудників на бактерії і небактеріі. Були відкриті наступні віруси: вірус тютюнової мозаїки; ящура; жовтої лихоманки; віспи і трахоми; поліомієліту; кору; вірус герпеса.

30-ті роки- основним вірусологічним методом, використовуваним для виділення вірусів та їх подальшої ідентифікації, є лабораторні тварини. 1931 р. - в якості експериментальної моделі для виділення вірусів стали використовуватися курячі ембріони, які мають високу чутливість до вірусів грипу, віспи, лейкозу. Відкрито: вірус грипу; кліщового енцефаліту.

40 роки:Встановили, що вірус осповакцини містить ДНК, але не РНК. Стало очевидним, що віруси відрізняються від бактерій не тільки розмірами і нездатністю рости без клітин, але і тим, що вони містять тільки один вид нуклеїнової кислоти - ДНК або РНК. Введення в вірусологію методу культури клітин стало важливою подією, яка дала можливість отримання культуральних вакцин проти поліомієліту, паротиту, кору та краснухи.

50-і роки:Відкрито віруси: аденовіруси; краснухи; віруси парагрипу.70-і роки:Відкриття у складі РНК-вмісних онкогенних вірусів ферменту зворотної транскриптази (ревертази). Стає реальним вивчення геному РНК вірусів. Відкрито віруси: вірус гепатиту B; ротавіруси, вірус гепатиту A. 80-і роки. Розвиток уявлень про те, що виникнення пухлин може бути пов'язано з вірусами. Компоненти вірусів, відповідальні за розвиток пухлин, назвали онкогенами. Відкрито віруси: імунодефіциту людини; вірус гепатиту C.

Методи культивування та ідентифікації вірусів (див. запитання 41)

38. Морфологія і ультраструктура вірусів. Типи симетрії вірусів. Хімічний склад, функції складових компонентів вірусів.

Морфологічні форми:

• сферичні(віруси грипу, кору)

• паличкоподібні

• кубоїдальні (віруси натуральної віспи, папіломи, аденовіруси)

• сперматозоїдні (віруси бактерій – фаги)

• зіркоподібні (астровіруси)

Віріон:

Нуклеїнова к-та (ДНК/РНК) або відповідний нуклеопротеїди, оточений однією або двома оболонками.

Капсида – перша оболонка, що оточує нуклеїнову к-ту. Містить капсомери – білкові субодиниці

Нуклокапсид – містить капсид разом з нуклеїновою кислотою. Характерний для простих вірусів

Суперкапсид – покриває нуклеокапсид. Наявний у складних вірусів. Складається з двошарової ліпідної або білкової мембрани. В нього занурені глікопротеїди, які утворюють шипи.

Капсомери розміщуються в певному порядку, залежно від характеру якого розрізняють 3 групи вірусів:

1. спіральний тип симетрії (нуклеокапсид трубчастої форми. Пр: вірус тютюнової мозаїки)

2. кубічний тип симетрії (ізометричні)

3. комбінований тип симетрії (Пр: збудник лейкозу, саркоми)

Хімічний склад:

• нуклеїнові кислоти ( ДНК або РНК)

• білки

• вуглеводи ( у ортоміксовірусів)

• ліпіди (у ортоміксовірусів)

39. Бактеріофаг,історія вивчення. Структура, класифікація фагів за морфологією. Методи якісного і кількісного визначення бактеріофагів. Практичне використання бактеріофагів.

Бактеріофаги-особливі представники вірусів, що здатні розмножуватися в клітинах бактерій,актиноміцетів,синьозелених водоростей.

Іх дія була відкрита на початку 20 ст. Твортом (1915) і Д'Ерелем(1917)

Класифікація за морфологією:

1-ниткоподібні фаги

2-сферичні

3-сферичні з рудиментом хвостика

4-з коротким хвостиком

5-з довгим хвостиком

6-з довгим хвостиком,що скорочується

Структура:

Т-парний бактеріофіг складається з ікосаедральної головки і хвостика спірального типу між якими розташований комірець. На кінці хвостика є 6-кутова базальна пластинка,від якої відходять 6 шипів і 6 ниток,які забезпечують прикріплення фага на поверхні бактерії. Хвостик складається із стрижня і чохла. Всередині стрижня є канал, через який фаг вводить у бактерію нуклеїнову кислоту. До складу чохла входить актиноподибний білок.

Інфекційну властивість бактеріофага визначають за допомогою:

1.Титрування в рідкому середовищі за методом Апельмана

2.Метод агарових шарів за Граціа

Використання бактеріофагів:

Використовують для фаготипування збудників інфекційних захворювань бактеріальної клітини, генноінженерній практиці, з лікувально-діагностичною метою при різних інфекційних захворюваннях.

40. Форми взаємодії бактеріофагів з бактеріальною клітиною. Вірулентні і помірні фаги. Характеристика продуктивної взаємодії. Лізогенія і фагова конверсія.

Взаємодія бактеріофагів з бактеріями відбувається стадійно:

1) адсорбція бактеріофагів на бактеріальній станці

2) бактеріофаг вводить у бактеріальну клітину свою нуклеїнову к-ту (ДНК або РНК

3) ін’єкція нитки ДНК (реалізується «феномен мікрошприца»)

За характером взаємодії бактеріофагів з клітиною-господарем вони поділяються на вірулентні (літичні) та помірні. Вірулентні бактеріофаги викликають продуктивну форму ін’єкції (бактеріофаг активно репродукується у бактерії-господарі). Вихід дозрілих бактеріофагів відбувається шляхом лізису клітини. Лізис здійснюється вільним лізоцимом і викликає загибель бактеріальної клітини. При продуктивному типі інфекції життєвий цикл фагів короткий. Так, для бактеріофага Т2 повний цикл репродукції заверщується через 13 хвилин. Із одного фага в інфікованій бактерії синтезується 200-300 нових віріонів.

Помірнібактеріофаги індукують редуктивну форму ін’єкції (геном бактеріофага проникає в клітину господаря, однак репродукції фага не відбувається, здійснюється так званий інтегративний механізм взаємодії: геном інтегрується в геном клітини-господаря, стає її складовою частиною. При цьому фаг переходить у стан профага ( профаг – геном бактеріофага, асоційований з бактеріальною хромосомою), а інфікована клітина стає лізогенною).

Лізогенія або лізогенний цикл — складна форма вірусної інфекції, під час якої від моменту зараження до лізису проходить певна кількість поколінь клітини.

Лізогенія— один з двох методів вірусного копіювання (інший — літичний цикл). В той час як літичний цикл зустрічається як серед вірусів тварин, так і серед бактеріофагів, лізогенія є частішою серед останніх. Лізогенія характеризується вставкою нуклеїнової кислоти вірусу до хромосоми клітини-господаря таким чином, що існує потенціал передачі отриманого генетичного матеріалу дочірнім клітинам під час поділу клітини. У цьому стані інформація, що міститься у вірусній нуклеїновій кислоті, не екпресується.

Стадії лізогенного циклу

1. Вірусний геном потрапляє з вірусом до клітини-господаря.

2. ДНК об'єднується з геномом клітини. На відміну від літичного циклу, утворення вірусних частинок і лізис клітини не відбуваються.

3. ДНК-полімераза клітини реплікує вірус у хромосомі.

4. Клітина діліться, а вірусні геноми передаються дочірнім клітинам. В кожному поколінні бактерій незначна частина клітин (шанс порядка 10^-6) піддається лізису з вивільненням 70 — 150 часток помірних фагів.

5. У будь-який момент, коли вірус активується, вірусний геном від'єднується від ДНК клітини і переходить до літичного циклу. Зазвичай невідомо, що саме активує вірус, але найбільш імовірними сигналами є концентрації гормонів та факторів росту в межах зараженої клітини. Частота переходу профага в інфекційний стан (індукція профага) може бути збільшеною рядом агентів (наприклад, ультрафіолетовим випромінюванням).

У лізигенному стані бактеріальні клітини можуть додатково набувати нових ознак, що детерміновані геномом бактеріофага (наприклад, токсигенність). Таке явище - зміна властивостей мікроорганізмів під впливом профага – одержало назву фагової конверсії.

41.Сучасні погляди на природу і походження вірусів. Місце вірусів у системі живого. Методи культивування вірусів та їх оцінка.

Походження вірусів

Віруси - збірна група, яка не має спільного предка. В даний час існує кілька гіпотез, що пояснюють походження вірусів.

Вважається, що великі ДНК-віруси походять від більш складних (і, можливо, клітинних, таких як сучасні мікоплазми і рикетсії), внутрішньоклітинних паразитів, які втратили значну частину свого геному. І дійсно, деякі великі ДНК-віруси (мімівіруса, вірус віспи) кодують функціонально надлишкові на перший погляд ферменти, очевидно, що залишилися їм у спадок від складніших форм існування. Слід також зазначити, що деякі вірусні білки не виявляють ніякої гомології з білками бактерій, архей і еукаріот, що свідчить про порівняно давнє відокремлення цієї групи.

.Походження деяких РНК-вірусів пов'язують з віроідами.

Положення вірусів у системі живого

Віруси мають генетичні зв'язки з представниками флори і фауни Землі. Згідно з останніми дослідженнями, геном людини більш ніж на 32% складається з інформації, кодованої вірус-подібними елементами і транспозони. За допомогою вірусів може відбуватися так званий горизонтальний перенос генів (ксенологія), тобто передача генетичної інформації не від батька до сина і так далі, а між двома неспорідненими особинами. Так в геномі вищих приматів існує білок сінцітін, який, як вважається, був привнесений ретровірусом. Іноді віруси утворюють з тваринами симбіоз.

Методи культивування вірусів.

Культури клітин. Приготування первинної культури клітин складається з декількох послідовних етапів: подрібнення тканини, роз'єднання клітин шляхом тріпсінізаціі, відмивання отриманої однорідної суспензії ізольованих клітин від трипсину з наступним суспензуванням клітин у живильному середовищі, що забезпечує їх зростання, наприклад в середовищі 199 з додаванням телячої сироватки крові. Перещеплювані культури на відміну від первинних адаптовані до умов, що забезпечує їм постійне існування, і зберігаються протягом декількох десятків пасажів. Перещеплювані одношарові культури клітин готують із злоякісних і нормальних ліній клітин, що володіють здатністю тривалий розмножуватися в певних умовах. До них відносяться злоякісні клітини HeLa, спочатку виділені з карциноми шийки матки, Нер-3 (з лімфоїдної карциноми), а також нормальні клітини амніону людини, нирок мавпи. До напівперещеплюваних культур відносяться диплоїдні клітини людини. Вони являють собою клітинну систему, що зберігає в процес 50 пасажів (до року) диплоїдний набір хромосом, типовий для соматичних клітин використовуваної тканини. Диплоїдні клітини людини не зазнають злоякісного переродження і цим вигідно відрізняються від пухлинних. Про розмноження (репродукції) вірусів в культурі клітин судять по цитопатичній дії (ЦПД), яке може бути виявлена мікроскопічно і характеризується морфологічними змінами клітин. Характер ЦПД вірусів використовують як для їх виявлення (індикації), так і для орієнтовної ідентифікації, тобто визначення їх видової приналежності. Один з методів індикації вірусів заснований на здатності поверхні клітин, в яких вони репродукуються, адсорбувати еритроцити - реакція гемадсорбції. Для її постановки в культуру клітин, заражених вірусами, додають суспензію еритроцитів і після деякого часу контакту клітини промивають ізотонічним розчином хлориду натрію. На поверхні уражених вірусами клітин залишаються прилип еритроцити. Інший метод - реакція гемаглютинації (РГ). Застосовується для виявлення вірусів у культуральній рідини культури клітин або хоріоналлантоісній або амніотичній рідині курячого ембріона. Кількість вірусних частинок визначають методом титрування за ЦПД в культурі клітин. Для цього клітини культури заражають десятикратним розведенням вірусу. Після 6-7-денної інкубації їх дивляться на наявність ЦПД. За титр вірусу приймають найбільше розведення, яке викликає ЦПД в 50% заражених культур. Титр вірусу висловлюють кількістю цитопатичних доз. Більш точним кількісним методом обліку окремих вірусних частинок є метод бляшок. Деякі віруси можна виявити та ідентифікувати за включеннями, які вони утворюють в ядрі чи цитоплазмі заражених клітин. Курячі ембріони. Курячі ембріони в порівнянні з культурами клітин значно рідше бувають контаміновані вірусами та мікоплазмами, а також володіють порівняно високою життєздатністю і стійкістю до різних впливів. Для отримання чистих культур рикетсій, хламідій і ряду вірусів у діагностичних цілях, а також для приготування різноманітних препаратів (вакцини, діагностикуми) використовують 8-12-денні курячі ембріони. Про розмноження згаданих мікроорганізмів судять по морфологічних змінах, що виявляються після розтину ембріона на його оболонках. Про репродукції деяких вірусів, наприклад грипу, віспи, можна судити з реакції гемаглютинації (РГА) з курячими або іншими еритроцитами. До недоліків даного методу відносяться неможливість виявлення досліджуваного мікроорганізму без попереднього розтину ембріона, а також наявність в ньому великої кількості білків та інших сполук, що ускладнюють подальшу очистку рикетсій або вірусів при виготовленні різних препаратів. Лабораторні тварини. Видова чутливість тварин до певного вірусу і їх вік визначають репродуктивну здатність вірусів. У багатьох випадках тільки новонароджені тварини чутливі до того чи іншого вірусу (наприклад, миші-сосунки - до вірусів Коксакі).  Перевага даного методу перед іншими полягає в можливості виділення тих вірусів, які погано репродукуються в культурі або ембріоні. До його недоліків відносяться контамінація організму піддослідних тварин сторонніми вірусами та мікоплазмами, а також необхідність подальшого зараження культури клітин для отримання чистої лінії даного вірусу, що подовжує терміни дослідження.