Файл: Практикум для студентов специальности 154 01 03 Физикохимические ме тоды и приборы контроля качества продукции.pdf

аминокислот.
Специфической реакцией на содержание белка является биуретовая реакция, так как ее дают полипептидные связи. Она получила свое назва- ние от производного мочевины – биурета, который образует в щелочном растворе медного купороса окрашенное комплексное соединение. Интен- сивность окрашивания пропорциональна содержанию пептидных связей, а следовательно, и концентрации белка в растворе.
Биуретовую реакцию дают все белки, пептоны и полипептиды, на- чиная с тетрапептидов. Эта реакция длительное время использовалась как качественная реакция на белок. В дальнейшем она стала применяться для количественного определения белка в различных объектах. Биуретовый метод применяют в разных модификациях, различающихся условиями экс- трагирования белка, способами внесения биуретового реактива и техникой колориметрирования.
Во второй группе качественных реакций белки осаждают действием солей, органических растворителей, концентрированных кислот, щелочей, ионов тяжелых металлов, температуры и в изоэлектрической точке. Белки в растворенном состоянии крайне неустойчивы, поэтому при добавлении органических растворителей (спирт, ацетон), концентрированных раство- ров нейтральных солей щелочных металлов и воздействии физических факторов (нагревание, облучение, ультразвук) гидратная оболочка разру- шается и они выпадают в осадок.
Анализ индивидуальных белков осуществляется после их выделения.
При этом обязательным условием является получение белков в индивиду- альном и, по возможности, неденатурированном состоянии, так как белки обычно теряют природные (нативные) свойства (растворимость, гидрата- цию, ферментативную активность и т. д.), подвергаясь денатурации под влиянием различных факторов.
Общая схема операций по выделению белков сводится к измельче- нию биологического материала (гомогенизации), экстрагированию и соб- ственно выделению, т. е. очистке и получению белка в индивидуальном состоянии.
Разрушение клеточной структуры осуществляется тщательным из- мельчением материала в гомогенизаторах, мельницах, попеременным за- мораживанием и оттаиванием, применением ультразвуковых высокочас- тотных колебаний, пресс-методов с использованием высоких давлений и метода «азотной бомбы».
Экстракция белков может быть совмещена с гомогенизацией клеток и тканей либо проведена отдельно, если продукт заранее измельчен. Для определения ферментативной активности белка достаточно одноразовой экстракции, тогда как для количественного определения белковых фрак- ций – трех- или пятикратной.
Большинство белков животных тканей хорошо растворимы в 5–10%-ных растворах солей, тогда как для перевода в раствор белков зерновых куль- тур применяют более широкий набор растворителей: буферные системы со

значениями рН от кислых до слабощелочных (фосфатные, боратные, цит- ратные), органические растворители.
Растворители подбираются с учетом разрыва в белках определенных типов связей. Так, уксусная кислота ослабляет ионные связи, сообщая мо- лекулам одноименные положительные заряды, мочевина – водородные и гидрофобные, салицилат натрия – гидрофобные и ионные, а водные рас- творы спиртов – водородные и гидрофобные взаимодействия. Органиче- ские растворители разрывают белок-липидные связи.
При изучении физико-химических свойств белков и их превращений в пищевых системах широко используют методы фракционирования и очистки от небелковых соединений. Они основаны на различиях таких свойств белков, как размер молекул, растворимость, заряд и сродство к специфическим химическим группам.
Осаждение белков из раствора под действием солей щелочных и ще- лочноземельных металлов называют высаливанием. Для высаливания чаще применяется сульфат аммония, под влиянием которого белки, как правило, сохраняют растворимость и ферментативную активность. Главную роль при высаливании играет не природа солей, а валентность ионов.
В практике выделения и очистки белков используются различные типы хроматографии: адсорбционная, распределительная, ионообменная и хроматография по сродству.
Использование методов электрофоретического разделения заключа- ется в способности молекул пептидов и аминокислот, находясь в заряжен- ной форме в виде катионов или анионов, передвигаться в электрическом поле с определенной скоростью.
В настоящее время распространены методы зонального электрофо- реза, диск-электрофореза, фронтального электрофореза.
В химии пищевого белка применяют и другие разновидности элек- трофоретического разделения (иммуноэлектрофорез, изотахофорез), а так- же метод пептидных карт и ультрацентрифугирование.
Очистка белков от низкомолекулярных соединений (солей, сахаров, аминокислот) осуществляется методами диализа, гель-фильтрации, кри- сталлизации, ультрафильтрации и с помощью полых волокон. При диализе используют полупроницаемые мембраны (целлофан, коллодийная пленка), через которые белки не диффундируют, а остаются внутри диализного мешочка. Более мелкие молекулы проходят через поры диализной мембра- ны и выходят в диализат.
Гомогенность белка определяется на последнем этапе выделения и очистки с применением по меньшей мере двух методов, оценивающих то или иное физико-химическое свойство. Наиболее достоверными являются ультрацентрифугирование в градиенте плотности, диск-электрофорез, им- мунохимические методы и растворимость. Если белок при электрофорезе представлен только одной полосой и обладает при этом максимальной биологической активностью, то он считается гомогенным.
Содержание белка в пищевых объектах обычно определяют по коли-

честву азота с использованием метода Кьельдаля. С целью упрощения и сокращения длительности анализа этот метод с момента его разработки
(1983) неоднократно модифицировался с применением различных катали- заторов и условий минерализации. На основе модифицированных методов созданы высокопроизводительные автоматические анализаторы типа
«Кьельфос», стоимость определения содержания белка на которых и сего- дня остается высокой.
Имеются и другие методы определения азота, такие как метод Дюма, нейтронно-активационный и с фенолятгипохлоритом на приборе «Техни- кон». Принцип метода Дюма заключается в разложении органического со- единения в атмосфере оксида углерода до газообразного состояния с по- следующим измерением объема азота (N
2
). В нейтронно-активационном методе атомы азота образца бомбардируются нейтронами в ядерном реак- торе с получением изотопа
13
N. Содержание белка рассчитывают по коли- честву гамма-лучей. Определение азота на приборе «Техникон» осуществ- ляется колориметрическим способом, в котором измеряется интенсивность сине-голубой окраски, образующейся по реакции взаимодействия сульфата аммония, выделяющегося в процессе минерализации образца, со щелоч- ным раствором фенола и гипохлорита. Все описанные методы по точности анализа не уступают методу Кьельдаля, однако они являются достаточно дорогими.
Известны методы количественного определения белка, основанные на различной степени помутнения (нефелометрический метод), способно- сти белков адсорбировать красители (кумасси синий, амидочерный и др.) и преломлять лучи света (по показателю преломления). Они характеризуют- ся высокой точностью и простотой определения, хотя имеют ряд ограни- чений. Наиболее удобными являются методы с кумасси синим, биурето- вый и Лоури. В основе биуретового метода лежит биуретовая реакция, в основе метода Лоури – восстановление фосфомолибденовой кислоты тиро- зином и триптофаном с одновременным протеканием биуретовой реакции.
По оптической плотности с использованием калибровочных графиков на- ходят концентрацию белка в растворе.
Для определения белка используется также метод инфракрасной спектроскопии, в основе которого лежит поглощение белками света с оп- ределенной длиной волны и измерение интенсивности его отражения в приборах-анализаторах. Приборы калибруют по образцам зерна (эталонам) с известным содержанием белка, определяемым по методу Кьельдаля.

медь; сернокислый калий; селен; 30%-ный водный раствор перекиси водо- рода; 0,1 н раствор серной кислоты; 4%-ный раствор борной кислоты; ме- тиловый красный; бромкрезоловый зеленый; этиловый спирт; аналитиче- ские весы; концентрированная серная кислота.
1. Общие сведения
Определение массовой доли белка методом Кьельдаля основано на минерализации навески продукта при нагревании с концентрированной серной кислотой в присутствии катализаторов. При этом углерод и водо- род органических соединений окисляются до диоксида углерода и воды; азот, освобождаемый в виде аммиака, соединяется в колбе с серной кисло- той, образуя сульфат аммония. Схематично происходящие реакции могут быть представлены следующим образом:
RCHNH
2
COOH + H
2
SO
4
→ CO
2
+ SO
3
+ H
2
O + NH
3
;
2NH
3
+ H
2
SO
4
→ (NH
4
)
2
SO
4.
На последующей стадии дистилляции раствор сульфата аммония об- рабатывают концентрированным раствором гидроксида натрия, при этом аммиак освобождается и улавливается титрованным раствором серной ки- слоты. Избыток серной кислоты оттитровывают раствором гидроксида на- трия.
Метод Кьельдаля применяют в нескольких модификациях, отли- чающихся в основном условиями минерализации. Для ускорения процесса вводят различные катализаторы: оксид меди, селен, свинец и другие, по- вышают температуру кипения серной кислоты добавлением солей, сульфа- та калия или натрия, сочетают добавление катализатора и солей при сжи- гании навески.
Методом Кьельдаля в любой модификации определяется количество общего азота. Массовая доля белка вычисляется умножением полученной величины общего азота на переводной коэффициент 6,25 исходя из того, что в белках в среднем содержится 16% азота. Однако не весь азот пище- вого продукта находится в форме белка и, кроме того, процентное содер- жание азота в белках подвержено колебаниям как в сторону повышения, так и в сторону понижения от 16%. В некоторых продуктах азотистые ве- щества небелкового характера достигают значительных количеств (мы- шечная ткань рыбы – 15%, мясо животных – 10–16% от общего количества азотистых веществ).
Следовательно, для получения более точных результатов необходи- мо при пересчете общего азота на белок использовать различные коэффи- циенты в зависимости от процентного содержания азота в белках отдель- ных продуктов: мясо и овощи – 6,25; пшеница, рожь, горох и др. – 5,7; гре- чиха, рис – 6,0; молоко – 6,37.
2. Порядок проведения испытаний
Подготовка к испытаниям. Подготовка проб к испытанию. Сред-

нюю пробу пищевого продукта готовят согласно требованиям метода от- бора проб.
Для пересчета содержания белка на сухое вещество (в случае необ- ходимости определения данного показателя) определяют влажность иссле- дуемого продукта или пищевого сырья.
Приготовление смешанных катализаторов. Катализатор 1. Сме- шивают 1 весовую часть сернокислой меди и 30 весовых частей сернокис- лого калия, тщательно растирают в ступке до получения мелкозернистого порошка.
Катализатор 2. Смешивают 10 весовых частей сернокислой меди,
100 весовых частей сернокислого калия и 2 весовые части селена. Тща- тельно растирают в ступке до получения мелкозернистого порошка.
При приготовлении катализаторов 1 и 2 допускается заменять серно- кислый калий надсернокислым калием в том же количестве.
Катализатор 3. 30 % водный раствор перекиси водорода.
Приготовление 4%-ного раствора борной кислоты. 40 г борной ки- слоты растворяют в небольшом количестве теплой дистиллированной во- ды при нагревании и переносят в колбу вместимостью 1000 см
3
. После ох- лаждения доводят объем дистиллированной водой до 1000 см
3
Проведение испытаний. Приготовление минерализата. Из усред- ненной измельченной гомогенной пробы исследуемого пищевого продукта для анализа взвешивают на обеззоленном фильтре или в пробирке точную навеску продукта, с погрешностью не более 0,1%. Содержание азота в ана- лизируемой пробе должно быть не менее 10 мг.
Минерализацию осуществляют одним из двух способов.
Способ 1. Добавляют в колбу Кьельдаля 1,5–2 г смешанного катали- затора 1 или 2. После прибавления катализатора осторожно приливают 10–
15 см
3
концентрированной серной кислоты.
Способ 2. Добавляют в колбу Кьельдаля 7–10 см
3 30%-ной перекиси водорода в качестве окислителя. После прекращения бурной реакции при- ливают такое же количество концентрированной серной кислоты.
Колбу покрывают стеклянной воронкой и устанавливают на нагрева- тель так, чтобы ее ось была наклонена под углом 30–45° к вертикали. Вна- чале колбу нагревают умеренно, чтобы предотвратить бурное пенообразо- вание.
При нагревании навеску время от времени помешивают вращатель- ными движениями колбы. После исчезновения пены нагревание усилива- ют, пока жидкость не будет доведена до постоянного кипения. При этом следят за тем, чтобы на стенках колбы не оставалось черных несгоревших частиц, смывая их легким встряхиванием содержимого колбы или прибав- лением небольшого количества серной кислоты.
После того как жидкость обесцветится (допускается слегка зеленова- тый оттенок), нагрев продолжают еще в течение 30 мин.
После охлаждения к содержимому колбы постепенно приливают, взбалтывая, около 70 см
3
дистиллированной воды, охлаждают и приступа-