3. От 0 до 10 микобактерии обнаружено в 1 длине мазка.

В этом случае необходимо продолжить исследование и просмотреть 3 длины (300 полей зрения). Возможны 3 варианта:

а) обнаружено 50 микобактерии; запись 50/>100 в поле зрения;

б) обнаружено менее 50 микобактерии; указывается их количе-
ство: 29/300 в поле зрения;

в) не обнаружено микобактерии; запись: 0/300 в поле зрения.
Можно провести аналогию этих результатов с более привычными

для нас понятиями обильного (массивного), умеренного и скудного бактериовыделения:

>50/100 в поле зрения — соответствует обильному,

10—50/100 в поле зрения — умеренному и

50/300 в поле зрения — скудному бактериовыделению.

Клиническое значение определения массивности бактериовыде­ления не вызывает сомнений. Установлена прямая корреляция между массивностью микобактериальной популяции, частотой развития ле­карственной устойчивости микобактерии и объемом деструктивного процесса у больных туберкулезом. У лиц с хроническими формами туберкулеза легких при ограниченных деструктивных поражениях отмечается менее интенсивное бактериовыделение (у 50% больных наблюдается отсутствие или небольшое число микобактерии в мок­роте), более редкое развитие лекарственной устойчивости к проти­вотуберкулезным препаратам и более частое прекращение бактерио­выделения в процессе лечения. При распространенном деструктив­ном туберкулезе легких большинство больных выделяют массивную бактериальную популяцию, содержащую в 63—78% случаев устой­чивых в противотуберкулезным препаратам микобактерии. У этих больных в 2 раза реже наступает прекращение бактериовыделения в результате химиотерапии. Сроки исчезновения микобактерии ту­беркулеза из мокроты в определенной степени коррелируют с мас­сивностью бактериовыделения до начала химиотерапии.

Отмечено, что положительная бактериологическая динамика, проявляющаяся в резком снижении микобактериальной популяции и полном ее исчезновении из мокроты, несколько опережает рент-геноморфологические признаки инволюции процесса. Именно в этот период на фоне исчезновения типичных бактериальных форм воз­будителя наиболее легко и демонстративно выявляются разнообраз­ные качественные изменения микобактерии, проявляющиеся в воз­никновении различных форм биологической изменчивости микроба.

Следует отметить также, что на фоне интенсивной противоту­беркулезной химиотерапии (особенно с включением в состав лечеб­ных комбинаций рифампицина) в последние годы отмечается фе­номен появления в мазках из разнообразного патологического ма­териала видимых под микроскопом и хорошо окрашивающихся по Цилю — Нильсену микобактерии, которые под влиянием лечебных препаратов на самом деле утратили жизнеспособность и способность размножаться на питательных средах. Этот феномен получил в литературе название «видимые, но нерастущие микобактерии». Для выявления этих микроорганизмов японские исследователи Murohashi и Yoshida (1957) предложили метод окраски «на живые и мертвые».

---

Метод основан на различной окраске ДНК микробной клетки у живых и погибших микобактерии. В последних она находится в деполимеризованном состоянии и теряет способность окрашиваться некоторыми анилиновыми основными красителями (в частности, метиленовым зеленым), однако воспринимает дополнительную ок­раску пиронином, сафронином или карболовым фуксином. На ок­рашенном препарате живые жизнеспособные микобактерии зеленые, а погибшие, не способные к размножению, — красные.

Таким образом, для обнаружения микобактерии имеется несколь­ко бактериоскопических мазков. Они достаточно просты, общедо­ступны и позволяют получить ответ в максимально короткий срок. Однако они не дают полной уверенности ни при положительном, ни при отрицательном результате бактериоскопии и потому, как правило, сопровождаются более чувствительным и результативным методом исследования — методом посева.

Метод посева, или культуральный метод выявления микобак­терии. Этот метод отличается большой чувствительностью и имеет ряд преимуществ перед методом микроскопии. Он позволяет выявить микобактерии туберкулеза при наличии в исследуемом патологиче­ском материале нескольких десятков жизнеспособных особей. Если сопоставить эту цифру с 10 000—100 000 микробных тел, присут­ствие которых необходимо в 1 мл материала для бактериоскопиче-ского выявления, то станет ясна значительно более высокая чувст­вительность метода посева. Это особенно важно при исследовании материала от впервые выявленных или уже леченных больных, выделяющих малые количества микобактерии.

Очень важным преимуществом метода культурального исследо­вания является возможность получения культуры возбудителя, ко­торая может быть подробно исследована, идентифицирована и изу­чена в отношении ее лекарственной чувствительности, вирулентно­сти и других свойств. Однако необходимо отметить, что существует ряд факторов, ограничивающих широкое применение метода куль­тивирования, в частности его высокая стоимость, известные огра­ничения, связанные со сложностью обработки патологического ма­териала, медленным размножением микобактерии туберкулеза и, следовательно, необходимостью долго ждать результатов исследова­ния. Все это снижает ценность метода, не дает возможности опе­ративно использовать полученные результаты в клинике и диктует необходимость проведения широкого поиска как более совершенных методов, так и более совершенных питательных сред, которые по­зволили бы ускорить получение результатов и повысить эффектив­ность и чувствительность метода.

Бактериологическому исследованию подвергается самый разно­образный материал: мокрота, промывные воды бронхов и желудка, экссудаты, отделяемое ран и свищей, моча, спинномозговая жид­кость, материалы биопсии и бронхоальвеолярного лаважа, органы экспериментальных животных и патологоанатомический материал. Материал для исследования должен доставляться в лабораторию в стерильной хорошо закрытой посуде. Перед посевом на питательные среды материал предварительно обрабатывают, что преследует дво­якую цель: 1) максимально гомогенизировать материал, подлежащий исследованию, с тем чтобы содержащиеся в нем микобактерии рав­номерно распределились в его объеме, чем облегчается их выделение; 2) необходимо «подавить» все другие микроорганизмы (гноеродные и гнилостные), содержащиеся в материале исследования, с тем чтобы в дальнейшем они как более быстро растущие не мешали росту микобактерии и не использовали приготовленные для микобактерии питательные вещества среды.

---

С этой целью для обработки патологического материала перед посевом на питательные среды используют различные реактивы. Это должно обеспечивать гомогенизацию материала, полностью по­давлять рост неспецифической гноеродной и гнилостной микрофло­ры, которая может находиться в исследуемом материале, и макси­мально сохранять жизнеспособность присутствующих в материале микобактерии. Перед посевом исследуемый материал нужно скон­центрировать и освободить от сопутствующей гноеродной микро­флоры. Для этого мокроту, экссудаты и другой материал помещают в стерильную склянку с бусами или битым стеклом и обрабатывают щелочью или кислотой. Жидкие материалы предварительно цент­рифугируют, и дальнейшей обработке подвергают только оса­док. В настоящее время для обработки патологического материала применяют следующие методы и детергенты.

1. Метод Гона — обработка растворами серной кислоты (2—6%) в зависимости от характера материала и степени его загрязненности неспецифической микрофлорой с последующим центрифугированием и отмыванием.

2. Метод Петрова — обработка 4% раствором NaOH с последу­ющим центрифугированием и нейтрализацией осадка перед посевом; этот метод удобно использовать при одновременной обработке боль­шого количества посевов. Щелочь растворяет белковые частицы, что способствует быстрой гомогенизации мокроты и других мате­риалов, содержащих гной и слизь, и высвобождению из этих бел­ковых частиц микобактерии туберкулеза.

3. Обработка 3% раствором серной кислоты в течение 20 мин (10 мин в спокойном состоянии, 10 мин при центрифугировании) с последующим 3-кратным отмыванием осадка стерильным изото­ническим раствором.

4. Обработка 1% раствором серной кислоты после тщательной гомогенизации в течение 18—20 ч при комнатной температуре (метод Б. Я. Циммер).

5. Обработка 10% раствором трехзамещенного фосфата натрия. Это широко распространенный в нашей стране метод, допускающий длительную экспозицию материала с фосфатом натрия без наруше­ния жизнеспособности микобактерии, что особенно ценно в тех случаях, когда доставка материала затруднена. Трехзамещенный фосфат натрия хорошо угнетает сопутствующую флору и даже при 2—3-дневном хранении материала не повреждает микобактерии и мало влияет на их способность к росту на питательных средах.

Метод можно применять в двух модификациях: с нейтрализацией материала или без нейтрализации. В последнем случае к осадку после центрифугирования добавляют 1 мл жидкой среды Школьни-

ковои и полученную смесь полностью засевают на питательные среды.

6. При посеве сильно загрязненного материала используют более концентрированные растворы серной кислоты (5%).

Следует отметить, что поиски веществ, подходящих для обра­ботки материала перед посевом, ведутся постоянно. Так, несколько лет назад было закончено коллективное исследование стран СЭВ по сравнительному испытанию подобных веществ. В качестве де­тергентов испытывались различные соединения: лауросепт X, некал ВХ, лаурилсульфат, хлоргексидин биглюконат и др. Оптимальные результаты были получены при применении лауросепта, который повысил на 16 % частоту выделения микобактерии туберкулеза. Однако отсутствие этого детергента ограничивает возможности его широкого применения на практике.

---

Для культивирования микобактерии туберкулеза используют раз­личные питательные среды: плотные, полужидкие, жидкие (синте­тические и полусинтетические). Однако ни одна из них не обладает качествами, предъявляемыми к ним современной бактериологиче­ской диагностикой туберкулеза. В связи с этим для повышения результативности культурального метода рекомендуется применять посев патологического материала одновременно на несколько (2—3) питательных сред. Для выделения чистых культур микобактерии туберкулеза чаще всего применяют различные по составу плотные питательные среды. В качестве стандартной среды для первичного выделения возбудителя и определения его лекарственной чувстви­тельности ВОЗ рекомендована среда Левенштейна — Йенсена. Это плотная яичная среда, на которой хороший рост микобактерии туберкулеза получают на 15—25-й день после посева бактериоско-пически положительного материала.

В последние годы широкое распространение в нашей стране получила яичная среда II, предложенная Э. Р. Финном (среда Фин-на-П), Она отличается от среды Левенштейна — Йенсена тем, что вместо L-аспарагина в ней используется глутамат натрия. На этой среде рост микобайтерий туберкулеза появляется на несколько дней раньше, чем на среде Левенштейна — Йенсена. Процент выделения культур на этой среде на 6—8% выше, чем на среде Левенштейна —

Для повышения вероятности получения роста микобактерии ре­комендуется засевать патологический материал на 2—3 различные по составу питательные среды одновременно. В настоящее время, кроме безаспарагиновой среды Финна-И, в практику внедряется еще одна безаспарагиновая среда, разработанная В. А. Аникиным. По данным Московского НИИ туберкулеза, применение сред, сбалан-сирбванных по солевому составу и источникам азотистого питания иначе, чем среда Левенштейна — Йенсена, культуральная диагно­стика туберкулеза улучшается в среднем на 6,7%. Это особенно важно при таких формах туберкулеза, при которых возбудитель паразитирует в условиях ацидоза и анаэробиоза, в частности, при туберкулезе мочеполовых органов.

Для повышения результативности культурального метода наряду с применением одновременно нескольких различных по составу питательных сред для посева рекомендуется повторное многократное исследование материала, так как в настоящее время отмечается состояние олигобациллярности у большинства больных даже со све-жевыявленными деструктивными поражениями в легких. Олигоба-циллярность проявляется не только малым количеством возбудите­лей в диагностическом материале, но и транзиторностью, эпизодич­ностью их выделения. Поэтому часто посев даже на 3 различные питательные среды не обеспечивает полной информации о состоянии бактериовыделения.

Для повышения информативности культурального метода прак­тикуется повторное многократное исследование материала от боль­ных. По данным Центрального НИИ туберкулеза, методика 3-крат­ного первичного комплексного исследования бактериоскопическими и культуральными методами у впервые выявленных больных де­структивным туберкулезом легких дает дополнительно 3,4% поло­жительных результатов, а у больных хроническим деструктивным туберкулезом, лечившихся до поступления в стационар, — 5,8% по сравнению с данными одноразового исследования. Однако, по данным ряда авторов, и 3-кратные посевы недостаточны для выяв­ления истинной картины бактериовыделения. Так, установлено, что при обследовании нелечившихся больных максимальный прирост информации о бактериовыделении можно получить при 6-кратных повторных посевах материала, при этом количество положительных результатов возрастает на 36—37% по сравнению с данными 3-кратного посева. У больных после 3-месячного лечения ценность многократного исследования патологического материала методом по­сева возрастает и при 6-кратном исследовании показатель прироста положительных результатов может достигать 70%, а после 6 мес лечения он возрастает до 82%.

---

Таким образом, кратность исследования и состав питательных сред имеют важное значение для культуральной диагностики ту­беркулеза.

В связи с тем что в процессе интенсивной химиотерапии про­исходит повреждение различных метаболических систем микробной клетки, ряд микроорганизмов в микобактериальной популяции ут­рачивает способность нормально развиваться на питательных средах. Отмечается снижение жизнеспособности микобактерии, что может проявляться отсутствием роста на общепринятых питательных сре­дах, а также возникновением способности расти только на осмоти­чески сбалансированных (полужидкие или даже жидкие) питатель­ных средах. Так, по данным И. Р. До рожковой, в процессе интенсивной противотуберкулезной химиотерапии часть микобактериальной попу­ляции, утрачивая способность расти на плотных питательных средах, в то же время приобретает свойство расти на полужидких питательных средах, образуя микроколонии в верхнем наиболее аэрируемом уча­стке питательной среды. Эта потребность в повышенной аэрации четко проявляется также при культивировании микобактерии в жидких питательных средах с увеличенной аэрацией, которая до­стигается при культивировании посевов во вращающемся термостате (Н. М. Макаревич).

После посева и закрытия пробирок материал должен быть рас­пределен по всей поверхности питательной среды, для этого пробирки наклоняют. Пробирки должны находиться в горизонтальном поло­жении в течение 24—48 ч, после чего их следует перевести в вертикальное положение.

Посевы нужно просматривать еженедельно. При этом обязательно регистрируются параметры: а) появление роста — срок появления, начиная со дня посева; б) интенсивность роста — число колоний, этот показатель имеет большое диагностическое и прогностическое значение, особенно если посевы производятся в динамике; в) за­грязнение посева посторонней микрофлорой или грибами; г) отсут­ствие роста.

При первичном посеве бактериоскопически отрицательного ма­териала на плотные среды средняя продолжительность роста состав­ляет 20—46 дней. Отдельные штаммы растут 60 и даже 90 дней. Это заставляет выдерживать посевы в термостате в течение 3 мес, еженедельно проверяя появление роста.

Обычно вирулентные культуры микобактерии туберкулеза растут на плотных питательных средах в виде R-форм колоний различной величины и вида. Колонии сухие, морщинистые, цвета слоновой кости, но в случае диссоциации могут встречаться и влажные, слегка пигментированные колонии, розовато-желтый пигмент которых рез­ко отличается от оранжевого или желтого пигмента сапрофитных или атипичных микобактерии. Последние обычно растут в S-форме. Следует отметить, что на среде Финна-И колонии микобактерии туберкулеза могут быть более влажными.

После курса химиотерапии от больных туберкулезом могут вы­деляться гладкие колонии с влажным ростом (S-формы). Гладкие колонии характерны также для Mycobacterium bovis, которые также патогенны для человека.

---

Смотрите также файлы

• Положение-каз. пр.131.doc

• прил. 3 к пр.218 с прил.1-3 гос.doc

• приказная 218 гос.doc

• прил. 2 к пр.218 гос.doc

• прил. 1 к пр.218 с прил.1-7 гос.doc