ВУЗ: Не указан
Категория: Не указан
Дисциплина: Не указана
Добавлен: 30.10.2019
Просмотров: 3989
Скачиваний: 33
Постановка и учет пластинчатой реакции
агглютинации (РА) на стекле
Пластинчатую (ориентировочную) РА
выполняют перед
постановкой развернутой реакции агглютинации
для того, чтобы
получить
предварительное представление о выделенном виде
или сероваре бактерий,
отобрать положительно реагирующие
со специфическими агглютинирующими сыворотками колонии
(чистой культуры бактерий), и исключить из дальнейших
исследований неагглютинирующиеся.
Пластинчатую РА ставят при комнатной температуре на
предметных стеклах.
Для этого пастеровской пипеткой наносят на стекла
раздельно друг от друга каплю сыворотки в небольшом
разведении (1:10 - 1:20) и каплю 0,5% раствора натрия хлорида
(контроль РА).
В каждую каплю (опытную и контрольную) вносят колонии,
снятые с поверхности плотной питательной среды, или петлю
суточной жидкой культуры бактерий.
Внесенные микроорганизмы тщательно перемешивают в
каплях жидкости до равномерного помутнения.
.\ГГЛ1&ТИНЯ111!Я
Контроль
Ш
КНРЖН iCJiUf&H (ИС1 апу|«)
1
ина«ик)
Рис.20.
Схема постановки пластинчатой реакции агглютинации
Результаты
реакции
учитывают
через
5-10
мин.
невооруженным глазом или с помощью лупы (5х).
При положительной реакции в капле с сывороткой
появляются крупные или мелкие хлопья, при отрицательной -
жидкость остается равномерно мутной (рис.20).
Для контроля сыворотки иногда добавляют еще одну,
вторую, контрольную каплю, в которой смешивают только
сыворотку и физраствор (натрий хлорид).
48
Занятие № 14
ГУМОРАЛЬНЫЙ ИММУННЫЙ ОТВЕТ.
ИММУНОГЛОБУЛИНЫ
Объемная реакция агглютинации
Практические навыки, приобретаемые на занятии
I. Постановка и учет объемной реакции агглютинации для
определения титра антител.
Алгоритм постановки и учёта объемной (развернутой)
реакции агглютинации для определения титра антител
В агглютинационные пробирки предварительно разливают
IU) 1 мл изотонического раствора натрия хлорида.
В первую из них доливают 1 мл сыворотки, предварительно
разведенной 1:100, и, перемешав ее с раствором натрия хлорида,
I мл переносят во вторую, из второй - в третью пробирку и т.д.
Получив, таким образом, двукратные разведения сывороток
(1:2, 1:4, 1:8, 1:16, 1:32, 1:64, 1:128, 1:256, 1:512 и 1:1024),
имосят в них по
1-2 капли стандартного антигена -
диагностикума (стандартную взвесь, содержащую до 1-2
миллиардов на мл бактерий).
Контролями
служат
изотонический
раствор
натрия
хлорида с антигеном и исследуемая сыворотка без него.
Пробирки энергично встряхивают и помещают на 2 ч в
1
срмостат при температуре 37°С, затем ведут предварительный
учет, начиная с контрольных.
Отсутствие агглютинации в контрольных пробирках и
и.тичие взвеси хлопьев в двух-трех и более пробирках опыта
сиидетельствует о положительной реакции (рис.21).
Окончательные результаты учитывают через 18-20 ч,
иыдерживая штатив с пробирками при комнатной температуре.
Кпн'Г^кьп.
cMBopvm
Рис.21,
Схема постановки развернутой реакции агглютинации
49
Интенсивность реакции выражается плюсами:
-++-
сыворотка прозрачная, с хлопьевидным осадком склеившихся
бактерий (агглютинат) на дне пробирки; "+++", "++" и "+" -
убывающие
просветления
с
уменьшением
содержания
агглютината.
Титром реакции агглютинации считают максимальное
разведение сыворотки, в пробирке с которым наблюдается
хорошо выраженная реакция агглютинации.
Заостряя внимание на образовании и характере осадка,
следует указать, что атрихиальные бактерии и риккетсии,
имеющие лишь соматические антигены, склеиваются через 18-20
часов с образованием мелкозернистых, трудно разбиваемых при
встряхивании
осадков;
жгутиконосные
бактерии
агглютинируются спустя 2 -^ часа в виде рыхлых, легко
взбиваемых хлопьев.
Занятие № 1 5
АЛЛЕРГИЯ (ГИПЕРЧУВСТВИТЕЛЬНОСТЬ)
Реакция преципитации
Практические навыки, приобретаемые на занятии
1. Проведение и учёт реакции преципитации по Асколи.
2. Учёт реакции преципитации по Манчини.
Алгоритм проведения и учёта реакции
преципитации РП по Асколи
В узкую пробирку диаметром 0,5 см с неразведенной
стандартной преципитирующей сывороткой в объеме 0,3-0,5 мл,
держа ее в наклонном положении, пастеровской пипеткой с тонко
оттянутым капилляром медленно по стенке наслаивается такой
же объем исследуемого антигена.
Пробирку осторожно, чтобы не смешать жидкости, ставят
вертикально. При правильном наслоении преципитиногена на
сыворотку возникает четкая граница между двумя слоями
жидкости.
Реакцию учитывают в зависимости от вида антигена и
антител через 5-10 мин., 1-2 часа или через 20-24 часа.
50
При положительной реакции в пробирке на границе между
сывороткой и исследуемым антигеном появляется преципитат в
имде кольца белого цвета.
Постановка
реакции
обязательно
сопровождается
коптролями
сыворотки (без нанесенного антигена) и антигена
(мпесенного в физраствор).
Учёт реакции преципитации по Манчини
Простая радиальная иммунодиффузия в геле является одним
и t вариантов реакции преципитации в геле (РПГ).
Реакция преципитации по Манчини ставится в гелевых
нластинах, которые уже содержат стандартное разведение
иреципитирующей сыворотки. В качестве геля для реакции
используют полиакриламидный гель или 1% хорошо отмытый
прозрачный агар. В геле имеются лунки, находящиеся на равном
|
111
сстоянии друг от друга, в которые вносят раствор, содержащий
рпчные концентрации антигена (или различные антигены). Для
каждой гелевой пластинки обязательно делается калибровка
му I'CM внесения в отдельный ряд лунок стандартных разведений
швестного антигена. После экспозиции в течение времени,
необходимого для протекания РПГ, учитывают результат.
11!игичие зоны преципитации в виде белого кольца вокруг лунок с
.111
|'игенами свидетельствует о положительной реакции, а диаметр
юны преципитации соответствует концентрации антигена в
п и )
1
ветствующей
лунке.
Концентрация
вычисляется
с
III пользованием калибровки - сравниваются размеры зоны
преципитации
вокруг
лунок,
содержащих
стандартные
концентрации известного антигена, с зоной вокруг лунки с
исследуемым антигеном (рис.22).
Например,
при
вычислении
концентраций
иммуноглобулинов различных классов и подклассов
в сыворотке
пациента в гель, нанесенный на стеклянные пластины, вносится
( гандартное разведение антииммуноглобулиновой сыворотки.
Для каждого класса и подкласса иммуноглобулина используется
огдельная
пластина,
содержащая
соответствующую
ему
мпгииммуноглобулиновую
сыворотку.
Затем
в
лунки,
находящиеся на пластинах, добавляют сыворотки пациентов, в
51
которых нужно определить концентрацию иммуноглобулинов
определенных
классов
и
подклассов.
После
экспозиции,
вычисляют концентрацию иммуноглобулина, сравнивая ширину
зоны преципитации вокруг лунки с калибровкой, сделанной для
соответствующей пластины (рис.22).
I е л ь . с о д е р ж а щ и й а ш н и м а
А г
А г,
А г
К о л ь ц о п р с ц п п н т з ш и и
( Д и а . м с г р
К о н ц е н т р а ц и и siii r n i c i i a ( i i a i i p . ,
I g C ;,
0 11
|><г,и»лисми
1
« в с ы в о р «
1
к с )
Рис.22.
Схема постановки и учета реакции преципитации
по Манчини
Существует также двойная или встречная иммунодиффузия
в геле. В этом случае и антигены и сыворотки вносятся в лунки,
расположенные в гелевых пластинах так, чтобы они находились
на равном расстоянии друг от друга. Диффундируя навстречу
друг другу и соединяясь друг с другом, антитела и антигены в
случае
положительной
реакции
преципитации
образуют
иммунологический комплекс в виде белой дуги («усов»)
преципитации, которые появляются в геле между лунками,
содержащими прореагировавшие компоненты РП.
Если РПГ ставится на чашках Петри, где в качестве
антигена используют бактериальную культуру, продуцирующую
экзотоксин (например, коринебактерии дифтерии), то этот метод
называется
реакцией преципитации по Оухтерлони
и является
вариантом реакции нейтрализации токсина антитоксической
сывороткой. В данном случае на центр агаризованной среды
накладывается полоска фильтровальной бумаги, пропитанной
антитоксической сывороткой (преципитирующая сыворотка), а с
обеих сторон от нее делается засев петлей исследуемых культур
бактерий, которые предположительно могут выделять экзотоксин
52
(преципитиноген). Контролями служат известные культуры
(тктерий,
обладающих
токсигенностью
(положительный
контроль) и лишенные токсигенности (отрицательный контроль).
Чашки термостатируют при условиях, оптимальных для роста
к'стируемой на токсигенность бактериальной культуры. При
с||ормировании
колоний
токсигенные
бактерии
вьщеляют
•к'ютоксин, который диффундирует в агар. В то же время в агар
мпистречу токсину диффундирует антитоксическая сыворотка
(рнс.23). Наличие дуг преципитации между колониями бактерий
и тем местом, где на агар наложена полоска фильтровальной
оумаги,
содержащая
антитоксическую
сыворотку,
I индетельствует
о
токсигенности
исследуемой
культуры.
( )|сутствие дуг преципитации указывает на отрицательный
результат:
отсутствие
у
бактерий
способности
вьщелять
тю токсин.
Рис.23.
Реакция преципитации по Оухтерлони: «-» -
нстоксигенная культура, « + » - токсигенные бактериальные
культуры
При наличии сложного по составу преципитиногена его
предварительно делят на составные компоненты и анализируют,
применяя современные варианты РПГ: иммуноэлектрофорез или
пммуноблоттинг. В основе метода иммуноэлектрофореза лежит
шсктрофоретическое разделение (под действием электрического
iDKii) на составные части сложного (состоящего из нескольких
53
отдельных белков) антигена в полиакриламидном геле. В
результате
в
геле
появляются
полосы,
соответствующие
отдельным белкам, которые изначально входили в состав
сложного антигена. Затем в гель вносится иммунная сыворотка
(обычно вырезают канавку в геле, расположенную параллельно
«пробегу» разделенных антигенов). Диффундируя навстречу друг
другу и соединяясь друг с другом, антитела и один (или
несколько) из составных компонентов сложного антигена в
случае
положительной
реакции
преципитации
образуют
иммунологический комплекс в виде «усов» преципитации. «Усы»
преципитации появляются в геле напротив той белковой полосы,
которая
содержит
соответствующий
(положительный)
используемой сыворотке компонент антигена (рис.24).
Рис.24.
Схема постановки иммуноэлектрофореза
Иммуноблотинг также начинается с электрофоретического
разделения сложного антигена на составные части. Однако, в
данном случае на полосы, образовавшиеся в полиакриламидном
геле, накладывают носитель (нитроцеллюлозную плёнку или
активированную бумагу) и продолжают электрофорез для
переноса белков на пленку (от англ.
blotting-
промокание). Затем
на
эту
плёнку
наносят
диагностическую
сыворотку
и
инкубируют. После отмывания несвязавшихся антител выявление
(визуализацию)
образовавшихся
приципитатов
проводят
с
помощью ИФА либо другим методом, позволяющим обнаружить
образовавшийся в нитроцеллюлозной пленке комплекс антиген -
антитело.
54
Занятие N9 16
ИММУНОПАТОЛОГИЯ и КЛИНИЧЕСКАЯ
ИММУНОЛОГИЯ. ОСОБЕННОСТИ
ТРАНСПЛАНТАЦИОННОГО И
ПРОТИВООПУХОЛЕВОГО ИММУНИТЕТА
1Ч‘акция связывания комплемента, оценка иммунного статуса
Практические навыки, приобретаемые на занятии
1 Постановка и учёт реакции связывания комплемента.
Расшифровка показателей иммунограммы.
Постановка и учёт реакции связывания комплемента
Пробирочный вариант реакции ставится в общем объеме 1,0
мл, при этом каждый из ингредиентов добавляется в рабочей до-
1
с. содержащейся в объеме 0,2 мл.
iiepjT семь пробирок:
■ в
первую
пробирку
вносят исследуемую сыворотку
(пациента), антиген и комплемент (опытная пробирка);
■ во вторую - положительную сыворотку, антиген и
комплемент (положительный контроль сыворотки);
■ в
третью
-
отрицательную
сыворотку,
антиген
и
комплемент (отрицательный контроль сыворотки);
■ в четвертую - исследуемую сыворотку, комплемент и
вместо антигена - 0,2 мл изотонического (0,85%) раствора
натрия хлорида (контроль испытуемой сыворотки);
■ в пятую - антиген, комплемент и 0,2 мл изотонического
раствора натрия хлорида вместо сыворотки (контроль
антигена);
■ в шестую - комплемент и 0,4 мл изотонического раствора
натрия хлорида (контроль комплемента);
■ в седьмую - только 0,6 мл 0,85% раствор натрия хлорида
(контроль гемснстемы).
Одновременно готовят гемолитическую систему, смешивая
равные
объемы гемолитической сыворотки в тройном титре и 3%
IIшесь эритроцитов барана.
Пробирки ставят в термостат при температуре 37°С на 20 -
»() минут. Затем во все пробирки добавляют по 0,4 мл
I смолитич§ской
системы
(индикаторная
система).
После
55
тщательного смешивания ингредиентов пробирки вновь ставят в
термостат при 37°С на 20-30 минут.
Результаты учитывают сразу после извлечения пробирок из
термостата и окончательную оценку делают после 15-18 часов
нахождения пробирок с РСК в холодильнике.
При
окончательном
учете
интенсивность
реакции
связывания комплемента оценивают по факту отсутствия реакции
гемолиза, отмечая результат реакции плюсами:
"++++" - резко положительная реакция с полной задержкой
гемолиза, жидкость в пробирке бесцветная, все эритроциты осели
на дно;
"+++", "++" - положительная реакция, отличается нарастанием
окраски жидкости вследствие гемолиза и уменьшения количества
эритроцитов в осадке;
"+" - слабоположительная реакция, жидкость интенсивно
окрашена,
на
дне
пробирки
незначительное
количество
эритроцитов.
Отрицательная
реакция
связывания
комплемента
обозначается знаком
при этом наблюдается полный гемолиз:
жидкость в пробирке имеет интенсивную алую окраску («лаковая
кровь»). Во всех контрольны х пробирках, за исключением
положительного контроля сыворотки и контроля гемсистемы,
при правильной постановке РСК должен наблюдаться гемолиз.
В настоящее время РСК ставят не в пробирках, а в
специальных планшетах, внося в лунки планшета те же
компоненты реакции и в той же самой последовательности и
комбинациях, что и в пробирочном варианте, но объем
компонентов РСК, вносимых в каждую из лунок, значительно
меньше (как минимум в 10 раз).
РСК является сложной серологической реакцией, в которой,
помимо
антигена,
и
антител
принимает участие третий
компонент - комплемент, способный связываться с комплексом
антиген-антитело и активироваться. РСК позволяет выявлять
антигены при наличии к ним специфических антисывороток или
антитела с помощью антигенов-диагностикумов.
Образование комплексов антиген-антитело и фиксация ими
комплемента, как правило, не сопровождается видимыми
изменениями, т.е. в большинстве случаев РСК не является
56
нндимой реакцией. Поэтому для выявления факта связывания
комплемента
используют
дополнительную
индикаторную
.ч-молитическую систему.
Эта система состоит из эритроцитов
ftupana,
обработанных
(нагруженных)
гемолитической
• кнюроткой (специфической для эритроцитов барана). Эту
1 1
.пюротку предварительно прогревают при температуре 56°С в
1
счение 30 мин. для разрушения ее собственного комплемента.
11ри внесении «чужого» комплемента (из сыворотки морской
шинки) в присутствии антнэритроцитарной гемолитической
I |.|
1
юротки происходит лизис эритроцитов барана.
Принцип метода состоит в том, что если в опытной системе
образовался комплекс антиген - антитело, который связал
добавленный комплемент, то лизис эритроцитов в индикаторной
I смолитической системе не произойдет, и результат РСК в
основной реакции будет положительным. В том случае, когда в
опытной системе (в основной реакции РСК) комплекс антиген -
ИМ гитело не формируется, и комплемент остается свободным, он
мшимодействует с гемолитической системой (вспомогательной,
индикаторной) и
вызывает лизис эритроцитов барана —
появляется гемолиз. В этом случае результат РСК будет
(ирицательным.
Вариантами РСК являются реакции радиального и
локального гемолиза в геле.
Принцип реакции радиального гемолиза в геле основан на
иммобилизации двух участников РСК: комплемента и антигена
(обычно роль антигена выполняют эритроциты барана) в
итровом геле. Затем в геле вырезают лунки, и в них вносится
||)стий участник РСК - антитела (например, гемолитическая
сыноротка). Диффундирующие антитела связывают антиген, и
||К
1
ивируют комплемент, который вызывает лизис антигена
(например, гемолиз), что проявляется появлением зон гемолиза
иокруг лунок. Размеры зон пропорциональны концентрации
пш ител в исследуемой сыворотке. В диагностических целях для
н|.
1
нвления
и
подсчета
титра
специфических
антител
к
н<»нкретному возбудителю в сыворотке пациентов эритроциты
Страна
«нагружают»
антигенами
(или
антигенными
/(С гсрминантами) различных возбудителей (например, вирусов
I риппа, краснухи), а в лунки вносят сыворотку больных.
57