ВУЗ: Не указан
Категория: Не указан
Дисциплина: Не указана
Добавлен: 30.10.2019
Просмотров: 3988
Скачиваний: 33
Принцип реакции локальн ого гемолиза в геле аналогичен
реакции радиального гемолиза. Однако в данном случае в гель
вносят эритроциты барана и суспензию клеток — продуцентов
антител, секретирующих специфические антиэритроцитарные
антитела. Антитела диффундируют в агар и фиксируются на
эритроцитах. Затем в реакционную систему вносят комплемент
(наслаивая его на агар) и наблюдают образование зон гемолиза
вокруг каждой клетки-продуцента, образующей антитела к
эритроцитам барана. Метод позволяет оценивать активность
антителообразования на уровне лимфоидных тканей и популяций
иммунных клеток после различных воздействий. Кроме того, с
помощью данного метода можно проследить динамику синтеза
антител к самым различным антигенам. Достаточно связать
любой из них с эритроцитами барана, которые вносят в гель.
Метод можно также применять для выявления различных классов
синтезируемых иммуноглобулинов.
О ценка иммунного статуса организм а человека
Оценка
иммунного
статуса
организма
человека
осуществляется на нескольких уровнях, каждый из которых
включает целый ряд тестов, позволяющих оценить состояние
естественного
врожденного
иммунитета
(факторов
неспецифической
резистентности)
и
специфического
приобретенного
клеточного
и
гуморального
иммунитета
(иммунологической реактивности) у каждого пациента.
Состояние
естественного
им мунитета
оценивают,
анализирую такие показатели, как:
• функционаньная
активность
фагоцитов
(клеточных
факторов естественного иммунитета),
• оценка активности системы комплемента (гуморального
фактора естественного иммунитета) по его концентрации,
необходимой для того, чтобы вызвать 50% гемолиз,
• содержание других гуморальных факторов естественного
иммунитета (например, интерферона и лизоцима).
Оценку специфического приобретенного клеточного
иммунитета осуществляют следующими методами:
• подсчет количества Т-лимфоцитов (подсчитывают Е-
розетки) в крови пациента.
58
• определение функциональной активности Т-лимфоцитов
осуществляют в реакциях бласттрансформации лимфоцитов
(РБТЛ), а также и по продукции ими гормонов тимуса,
лимфокинов и т.д.
Оценку
специфического приобретенного гуморального
иммунитета
проводят учитывая:
• количество В-лимфоцитов (с помощью ЕАС-розеток),
• функциональную
активность
В-лимфоцитов
-
по
продукции ими иммуноглобулинов различных классов, а
также по способности образовьшать бласты в РБТЛ и др.
Основные показатели, которые необходимо определить для
оценки иммунного статуса пациента, обычно представлены в
ниде иммунограммы. Студент должен уметь расшифровать эти
показатели.
Расшифровка показателей иммунограммы
Показатель
( I U _
<
1»4
( 1>8
(1)16
< 1)19 (CD20, CD22
« 1)25
« 1)95
ПРИ CD4/CD8
ФЧ
•1>И
П150
ЦИК
Характеристика
Все популяции Т-лифоцитов, клеточный иммунный швет
Т_ПиГ/Ьл¥11ЛП¥ _
_
_______ Л4.________«
.
Т-лифоциты - хелперы, клеточный иммунный ответ
Т'
____ 17’
7~ ------------ ^ ^ ------
Т-лифоциты - киллеры/супрессоры, клеточный иммунный ответ
MlT-b’TIfvrVM
_____
м
__
_
------л--
I---J—1---
NK-клетки, естественный неспецифический иммунитет
В-лимфоциты, гуморальный иммунный ответ
Активированные Т- и В-лимфоциты, клеточный и гуморальный
иммунный ответ
Рецепторы апоптоза на терминально дифференцированных Т- и
В-лимфоцитах
Иммунорегуляторный индекс -
соотношение Т-хелперы/Т-
супрессоры, клеточный иммунный ответ
Фагоцитарное число, оценка фагоцитоза, естественный
неспецифический иммунитет
Фагоцитарный индекс, оценка фагоциггоза, естественный
неспецифический иммунитет
МСТ-тест
1([М
1к(;
IgA
Активность комплемента - по его концентрации, вызывающей
50% гемолиз, есгесгвенный неспецифический иммунитет
------------ ------- -----------'У » «
J ЦТЖ
». V 1.____
Циркулирующие иммунные комплексы - оценка гуморального
иммунного ответа и активности фагоцитов (естественный
неспецифический иммунитет)
Тест с нитросиним тетразолием - активности фагоцитов
(естественный неспецифический иммунитет)
Иммуноглобулин М, гуморальный иммунный ответ
Иммуноглобулин G, гуморальный иммунный ответ
Иммуноглобулин А. гуморальный иммунный ответ
59
Показатель
РБТЛ
ФГА
ЛПС
КонА
Характеристика
Фитогемагглютанин - митоген, активирующий РБТЛ (Т-
лимфоцитов)
Л
ИМФОЦИТОВ^
___ ______ _
Пипппописахапид- мтоген, активирующий РБТЛ (В-лимфоцшов^
—--------- -------------
.
____________ __________ DCTTT /'Т -ттм м тлп иТ Л В !
J 1ИП01ЮЛИСаА<ШПА~
------- -Z------------ i-----------
f
Конканавалин A - митоген, aKTHBHpyroffljitt РБТЛ (Т-лимфоцитов)
Сокращения:
CD - кластеры дифференцировки, маркерные молекулы на
мембране иммунных клеток.
РБТЛ - реакция бластгрансформации лимфоцитов.
Занятие № 1 7
ИММУНОПРОФИЛАКТИКА И ИММУНОТЕРАПИЯ
ИНФЕКЦИОННЫХ БОЛЕЗНЕЙ. ВОЗРАСТНЫЕ
ОСОБЕННОСТИ ИММУНИТЕТА
Серологические
реакции с использованием метки.
Постановка прямой и непрямой РИФ
Практические навыки, приобретаемые на занятии
1. Учёт реакции иммунофеиотипирования лимфоцитов.
Учёт реакции иммунофеиотипирования лимфоцитов
Иммунофенотипирование
лимфоцитов
проводят
для
подсчета функционально активных Т-
и
В-лимфоцитов
в
периферической крови пациентов. Вследствие различии в
строении клеточных мембран Т- и В-лимфоцитов они по-разному
способны связывать эритроциты, содержащиеся, например, в
крови барана.
Замечено, что при смешивании лимфоцитов человека и
эритроцитов барана происходит избирательное связывание
эритроцитов с рецепторами Т-лимфоцитов и образование так
называемых
Е-розеток,
которые легко выявить при микроскопии
препарата, приготовленного из периферической крови пациента с
добавлением эритроцитов барана. В центре такой розетки
находится Т-лимфоцит, окруженный прилипшими к нему
эритроцитами. Функционально активным считается Т-лимфоцит,
связавший, как минимум, три эритроцита.
60
Для подсчета функционально активных В-лимфоцитов в
и. |
1
|
1
(||срической крови пациентов используют метод ЕАС-
|)<||<чок. В данном случае В-лимфоциты не содержат рецепторов
mil непосредственного связывания эритроцитов, но на них есть
[и'игторы для связывания комплемента. Поэтому эритроциты
• ■iipiiiiii предварительно инкубируют с антиэритроцитарными
им I и налами, а затем с комплементом. Такие эритроциты уже
■
1
И
)1
()Г)
11
ы
присоединяться
к
В-лимфоцитам
через
►
пммлсментсвязывающие рецепторы. Отсюда и название метода;
I Л ('
розетка, где Е - эритроцит, А - антитело, С - комплемент.
'1*у|1кционально
активным
также
считается
В-лимфоцит,
'
ми
иппиий, как минимум, три эритроцита.
Па данном занятии студент должен также усвоить
t иодующие практические задачи:
I
Чиать алгоритм постановки прямой и непрямой реакции
иммупофлюоресценции (РИФ).
Чиагь
алгоритм
постановки
твердофазного
иммуноферментного анализа (ИФА).
Алгоритм постановки прямой РИФ
На обезжиренном предметном стекле с использованием
III лледуемого патологического материала (либо чистой культуры
|и> (будителя) делают тонкие мазки, а из органов и тканей - мазки-
о течатки . Препараты подсушивают, фиксируют, наносят на них
||Ц)минесцирующую (флюоресцирующую) сыворотку, взятую в
|
1
.|()очем разведении, и помещают во влажную камеру при
и-ммературе 37°С на 20-30 мин. (или на 25-40 мин при 18-2Г С ).
Затем для удаления избытка флюоресцирующих антител
препарат промывают в забуферном изотоническом растворе
ти р и я хлорида в течение
10-15 мин. с последующим
ополаскиванием в дистиллированной или проточной воде в
к'мение
10 мин.,
сушат при комнатной температуре и
|||)()сматривают с использованием люминесцентного микроскопа.
Интенсивность специфической реакции флюоресценции
(тктериальных клеток оценивают по четьфехплюсовой шкале:
"<-+++" - очень яркая; "+++" - яркая; "++" - выраженная
I (Полочная флюоресценция;
- слабое свечение клеток.
61
Обязательны
три
контроля
—
обработанные
флюоресцирующими антителами суспензии:
1) гомологичных бактерий (положительный контроль);
2) гетерологичной культуры (отрицательный контроль);
3) незараженного материала (отрицательный контроль ).
X
X
ПРЯМОЙ ТЕСТ
Mgimntbte
6у)мны, меченные
фпюорвсцвином фпюорвсцвйном
НЕПРЯМОЙ ТЕСТ
Рис.25.
Схема постановки прямой и непрямой РИФ:
АГ - антиген
Алгоритм постановки непрямой РИФ
На обезжиренном предметном стекле из исследуемого
материала делают тонкие мазки, а из органов и тканей - мазки-
отпечатки.
Препараты подсушивают, фиксируют, наносят на них
обычную специфическую сыворотку,
взятую в рабочем
разведении, и помещают во влажную камеру при температуре
З Т С
на 20-30 мин. (или на 25-40 мин. при 18-2ГС).
Затем для удаления избытка антител препарат промывают в
забуферном изотоническом растворе натрия хлорида в течение
10-15 мин. с последующим ополаскиванием в дистиллированной
или проточной воде в течение 10 мин.
Препараты
подсушивают,
наносят
на
них
флюоресцирующую антииммуноглобулиновую (специфически
взаимодействующую
с
иммуноглобулинами
человека)
сыворотку
(рис.25), взятую в рабочем разведении, и снова
62
пимсщают во влажную камеру при температуре 37°С на 20—30
МММ. (или на 25-40 мин. рис. 18-21°С).
("ушат при комнатной температуре и просматривают с
(II пользованием люминесцентного микроскопа и
масляной
иммерсионной системы.
Интенсивность специфической реакции флюоресценции
||(
1
К
1
сриальных клеток оценивают по той же схеме, что и при
1
ИК' гановке прямой РИФ.
Алгоритм постановки твердофазного
иммуноферментного анализа
В настоящее время чаще применяется твердофазная
модификация
ИФА,
при
этом
антитела
или
антигены
t орбируются в лунках полистироловых планшетов (на твердой
ф|пс). В большинстве случаев к твердой фазе присоединяются
.
1
пгн
1
ены, которые при инкубации с сыворотками пациентов
унаиливают специфические антитела.
К
образовавшемуся
при
этом
иммунокомплексу
прибавляются
затем
меченные
ферментом,
например,
iu-роксидазой, антииммуноглобулиновые антитела, специфически
шанмодействующие
с
любыми
антителами
(иммуноглобулинами)
человека.
Меченная
ферментом
1
Ипииммуноглобулиновая
сыворотка
называется
иммуноферментный конъюгат
(рис.26).
В результате связывания иммуноферментного конъюгата с
1 1
.
1
И()роткой пациента образуется иммуноферментный тройной
комплекс, при добавлении к которому ортофенилендиамина
(хромогена) и Н
2
О
2
в качестве субстрата для пероксйдазы
происходит пожелтение в лунке. Изменение цвета хромогена
обусловлено
появлением
химически
активного
продукта
ферментативной реакции -
супероксиданиона кислорода в
||
1
- (ультате расщеплении перекиси водорода пероксидазой.
63
—
Анпген сорбирован HI ппаншв!»
Охшишж
• (Ф
)
АТф
• СувС11»Я(С)
ВЕЕВ
Рис.26. Схема постанови! твердофазного ИФА для выявления
специфических антител в сыворотке пациента:
АГ - антиген, АТ - антитело, АТ-Ф - антитела, меченные
ферментом, С - субстрат
Результаты твердофазной модификации ИФА (изменение
цвета)
учитывают
с
использованием
специального
спектрофотометра.
В
качестве
меток
для
видовой
антииммуноглобулиновой сыворотки, кроме пероксидазы, могут
использоваться и другие ферменты.
Занятие № 18
И Т О ГО В О Е ЗА Н ЯТИ Е П О И М М У Н О Л О ГИ И
Перечень практических навыков по иммунологии
1. Определение титра лизоцима в слюне (алгоритм проведения
и оценка результата).
2.
Вьиисление по мазку фагоцитарного числа и фагоцитарного
индекса.
3. Определение активности системы комплемента (алгоритм
проведения и оценка результата).
4. Проведение и учёт пластинчатой реакции агглютинации на
стекле.
64
Проведение и учёт объёмной реакции агглютинации для
определения титра антител.
^
1
. 11роведение и учёт реакции преципитации по Асколи.
7. Учёт реакции преципитации по Манчини.
«. I Остановка и учёт реакции связывания комплемента.
‘). 1’асшифровка показателей иммунограммы.
К).Учёт реакции иммунофенотипирования лимфоцитов.
I I. Иммунопрепараты.
65
I
М Е Д И Ц И Н С К А Я Б А К Т Е Р И О Л О Г И Я С
О С Н О В А М И М И К О Л О Г И И И П Р О Т О З О О Л О Г И И
Занятие № 1 9
СТАФИЛОКОККИ. СТРЕПТОКОККИ. НЕЙССЕРИИ
Микробиологическая диагностика заболеваний, вызываемых
стафилококками, стрептококками, нейссериями
Практические навыки, приобретаемые на занятии
1. Приготовление фиксированного мазка (повторение навыка для
его закрепления).
2. Окраска фиксированного мазка по Граму (повторение навыка
для его закрепления).
3. Микроскопирование окрашенного мазка с помощью
иммерсионной микроскопии (повторение навыка для его
закрепления).
4. Идентификация по мазку стафилококка (повторение навыка
для его закрепления).
5. Идентификация по мазку стрептококка (повторение навыка
для его закрепления).
6. Выявление в мазке из уретрального гноя гонококка или в мазке
из осадка ликвора - менингококка.
7. Определение вирулентности бактериальной культуры по
косвенным признакам (наличие гемолитической активности,
наличие лецитиназной активности, наличие
плазмокоагулазной активности) (повторение навыка для его
закрепления).
8. Метод дисков для определения устойчивости бактериапьной
культуры к антибиотикам (проведение и учёт) (повторение
навыка для его закрепления).
9. Алгоритм проведения и учёт фаготипирования бактериальной
культуры.
10.
Иммунопрепараты (повторение навыка для его
закрепления).
При идентификации окрашенного по Граму мазка,
приготовленного
из клинического материала,
стафилококк:
И
1
.
1
ИИЛЯЮТ в виде скоплений грамположительных кокков, кроме
IOK), в мазках присутствуют полиморфноядерные лейкоциты.
Микроскопические исследования окрашенных мазков могут
ту ж и ть основанием только для предварительного диагноза.
Ведущим методом является культуральный - получение
•I ногой
культуры
на
желточно-солевом
агаре
^ С А ) ,
»
1
-
11
СКТИВНОЙ среде, на которой хорошо проявляется способность
I п
1
(|)илококка к пигментообразованию (золотистый пигмент у
(илогистого стафилококка,
S. aureus)
и разложению лецитина
1
.||«‘
11
и гиназная активность).
У вьщеленной чистой культуры стафилококка выявляют
шкжс
плазмокоагулазную
активность:
способность
Shiphylococcus aureus
вызывать коа
1
у'ляцию (свертывание) плазмы
•чнти с образованием сгустка. Сам фермент не взаимодействует с
фибриногеном,
а
образует
тромбиноподобное
вещество,
|||н-дположительно
взаимодействующее
с
протромбином.
I >||р
1
пующаяся фибриновая плёнка играет роль своеобразной
мшкипштельной капсулы, защищающей бактерию.
Для ф аготипирования используют стандартный набор из
I (шктериофагов, разделённых на 4 группы, которые включают
I ш'дующие фаги:
■ 1 -я группа - 29, 52, 52А, 79, 80,
- 2-я - ЗА, ЗС , 55, 71,
■ 3-я - 6, 42Е, 47, 53, 54, 75, 77, 83А, 84, 85,
- 4 -я -9 4 ,9 5 ,9 6 , 81.
Один штамм бактерий может лизироваться только одним
фш
1
)м или сразу несколькими фагами.
При вы явл ен и и чувствительности к антибиотикам
« ||('дуег учитывать, что значительная часть выделенных в чистой
ш.гурс бактерий
S. aureus
может быть устойчива к Р-лактамным
.|М
111
(
1
И()тикам, поскольку стафилококк продуцирует Р-лактамазы.
/1пи определения чувствительности к антибиотикам используют
м гю д дисков или серийны х разведений.
Ни
п лотны х агари зован н ы х средах с кровью по
)• мплигической акти вн ости в ы я вл я ю т а - (дают частичный
itMuiiin и позеленение среды вокруг колоний), р - (полностью
66
67