ВУЗ: Не указан
Категория: Не указан
Дисциплина: Не указана
Добавлен: 31.10.2019
Просмотров: 2995
Скачиваний: 1
41
ЗАНЯТИЕ № 13
САМОСТОЯТЕЛЬНАЯ АУДИТОРНАЯ РАБОТА
ПО ТЕМЕ
«ЭНЕРГЕТИЧЕСКИЙ ОБМЕН. РОЛЬ КИСЛОРОДА
В ПРОЦЕССАХ ОКИСЛЕНИЯ В КЛЕТКЕ»
Задания для самостоятельной работы:
1.
Изобразить общую схему энергетического обмена.
2.
Показать взаимосвязь ЦТК и ЦТД.
3.
Указать витаминзависимые ферменты ЦТК.
4.
Показать анаболические функции ЦТК.
5.
Отметить регуляцию ЦТК.
6.
Решение ситуационных задач.
42
Дата: _______________
ЗАНЯТИЕ № 15
РАБОТА № 1. ОПРЕДЕЛЕНИЕ АКТИВНОСТИ
СУКЦИНАТДЕГИДРОГЕНАЗЫ
ОБОСНОВАНИЕ ВЫПОЛНЕНИЯ РАБОТЫ. СДГ один из клю-
чевых ферментов цикла трикарбоновых кислот, прочно связанный с
внутренней мембраной митохондрий. Роль кофермента выполняет
ФАД, соединенный с белком ковалентной связью. Фермент
in vivo
окисляет янтарную кислоту (сукцинат):
ФАД ФАДН
2
СООН СООН
СН
2
СН
СН
2
сукцинатдегидрогеназа СН
(СДГ)
СООН СООН
Сукцинат Фумарат
Работа дает представление о дегидрогеназных реакциях в ЦТК.
ПРИНЦИП МЕТОДА
Субстрат – янтарная кислота. Конечный акцептор водорода –
2,6-дихлорфенолиндофенол (синий цвет), который при восстановле-
нии превращается в бесцветную лейкоформу. Источником фермента
является отмытая мышечная ткань. В опыте (
in vitro
) ход реакций
следующий:
43
Малонат является конкурентным ингибитором фермента СДГ.
ХОД РАБОТЫ:
А. Получение ферментного препарата
2 г свежих мышц измельчают ножницами, гомогенизируют с не-
большим количеством воды. Мышечную кашицу переносят на двой-
ной слой марли (воронка) и промывают 25 мл воды. Отжатую мы-
шечную массу переносят в пробирку, добавляют 4 мл воды, размеши-
вают стеклянной палочкой и суспензию равномерно разливают в 4
пробирки.
Б. Определение активности фермента
Взять четыре пробирки и приготовить инкубационные смеси в
соответствии со схемой:
№ пробирки
отмерить
1
2
3
4
Ферментный препарат
(гомогенат ткани)
Н
2
О
Малонат
Сукцинат
2,6-
дихлорфенолиндофенол
1,0 мл
кипячение
2 минуты
0,5 мл
-
1,0 мл
2 капли
1,0 мл
-
0,5 мл
-
1,0 мл
2 капли
1,0 мл
-
1,5 мл
-
-
2 капли
1,0 мл
-
-
0,5 мл
1,0 мл
2 капли
Перемешать. Инкубация 15 минут при 37
о
С
в термостате
44
РЕЗУЛЬТАТ:
ВЫВОД:
РАБОТА № 2. ОПРЕДЕЛЕНИЕ АКТИВНОСТИ
ЦИТОХРОМОКСИДАЗЫ
ОБОСНОВАНИЕ ВЫПОЛНЕНИЯ РАБОТЫ. Цитохромокси-
даза является хромопротеином, содержит геминовую группу и Cu
2+
,
активна в растительных и животных тканях, осуществляет перенос
электронов на кислород в цепи тканевого дыхания. Определение ак-
тивности фермента дает представление о функционировании цепи
переноса электронов.
ПРИНЦИП МЕТОДА. Смесь -нафтола и п-фенилендиамина
(реактив «Нади») окисляется цитохромоксидазой в присутствии ки-
слорода, образуя продукт конденсации индофеноловый синий по
схеме:
45
ХОД РАБОТЫ:
А. Получение ферментного препарата
0,5 г свежих мышц растирают в ступке с 10 мл Н
2
О. Воду слива-
ют, мышечную ткань просушивают фильтровальной бумагой.
Б. Определение активности фермента
Мышечную ткань разделяют на 2 части. Одну помещают на
фильтр, другую переносят в пробирку, добавляют 1 мл Н
2
О и кипятят
1 минуту. После охлаждения извлекают прокипяченную мышечную
ткань стеклянной палочкой и помещают на фильтр.
На обе порции мышц наносят по 2 капли реактива «Нади»
(смесь п-фенилендиамина и -нафтола). Инкубация 5-10 минут, при
температуре 18
о
С (комнатная).
РЕЗУЛЬТАТ:
ВЫВОД: