ВУЗ: Не указан
Категория: Не указан
Дисциплина: Не указана
Добавлен: 03.11.2019
Просмотров: 3826
Скачиваний: 1
83.
пробы.
Микробиологическая диагностика гриппа Этиология: вирусы гриппа (семейство
Orthomyxoviridae) – РНК-содержащие оболочечные вирусы, обладающие
сродством
к
муцину.
Сбор клинического материала (мазки из носа и зева) производят в стерильные
одноразовые флаконы. Забор мазков необходимо осуществлять в первые сутки
заболевания до этиотропного лечения. Мазки из носа и зева собирают стерильным
тампоном, который вводят поочередно в обе ноздри на глубину 2–3 см, дают
пропитаться секретом в течение 3 минут, после чего вращательным движением
тампон извлекают и погружают в пробирку с 2 мл транспортной среды, отламывая
нестерильный конец палочки. Материалы из зева собирают аналогичным образом,
плотно прижимая тампоны к пораженным гиперемированным участкам миндалин
и задних фарингиальных отделов. Тампон из зева помещают в одну пробирку с
тампоном
из
носа.
Пробирки незамедлительно (в течение 1–4 часов) доставляют в лабораторию.
Каждая проба указанного биологического материала сопровождается
информационной
картой
пациента
.
Образец
направлен
Обследование пациентов с острыми респираторными вирусными инфекциями
(ОРВИ) включает индикацию вирусных антигенов в биоматериалах (экспресс-
диагностика), выделение вирусов, а также выявление специфических антител в
сыворотках больных в острой фазе инфекции и стадии реконвалесценции
(используются парные сыворотки) (Инструкция по лабораторным методам
диагностики гриппа и других острых респираторных вирусных инфекций.
Утверждена постановлением Министерства здравоохранения Республики
Беларусь от 1 ноября 2000 г. № 48). Эти мероприятия являются обязательными
при проведении лабораторного обследования больных с данной патологией.
Для массовой серодиагностики с целью ретроспективного подтверждения
диагноза используются серологические реакции, такие, как реакция торможения
гемагглютинации (РТГА), реакция связывания комплемента (РСК), реакция
нейтрализации (РН), а также методы иммуноферментного (ИФА) и
иммунофлюоресцентного анализа.
84.
Образец
направлен
Обследование пациентов с острыми респираторными вирусными инфекциями
(ОРВИ) включает индикацию вирусных антигенов в биоматериалах (экспресс-
диагностика), выделение вирусов, а также выявление специфических антител в
сыворотках больных в острой фазе инфекции и стадии реконвалесценции
(используются парные сыворотки) (Инструкция по лабораторным методам
диагностики гриппа и других острых респираторных вирусных инфекций.
Утверждена постановлением Министерства здравоохранения Республики
Беларусь от 1 ноября 2000 г. № 48). Эти мероприятия являются обязательными
при проведении лабораторного обследования больных с данной патологией.
Для массовой серодиагностики с целью ретроспективного подтверждения
диагноза используются серологические реакции, такие, как реакция торможения
гемагглютинации (РТГА), реакция связывания комплемента (РСК), реакция
нейтрализации (РН), а также методы иммуноферментного (ИФА) и
иммунофлюоресцентного анализа. эпидемических вспышек с целью проведения
соответствующих
профилактических
и
лечебных
мероприятий.
В
последнее
время
широкое
распространение
получил
метод
иммунофлюоресцентной диагностики гриппа и других ОРВИ. Наряду с ним
внедряется и метод ранней диагностики гриппа, основанный на применении ИФА.
Прямой метод иммунофлюоресцентного анализа позволяет обнаружить вирусные
антигены по их характерной локализации непосредственно в клетках
цилиндрического эпителия за счет взаимодействия антигенов со специфическими
противовирусными антителами, меченными флюоресцеинизотиоцианатом. По
чувствительности данные методы не уступает другим лабораторным методикам,
однако для правильной интерпретации результатов необходим определенный
опыт работы. Тщательная микроскопия мазков требует значительного внимания и
времени, что ограничивает возможности исследований и вносит элементы
субъективизма
в
заключительный
анализ.
Для получения клинического материала поочередно в обе полости носа на
глубину 2–3 см вводят тампон легким движением по наружной стенке носа. Затем
тампон слегка опускают книзу, вводят в нижний носовой ход, прижимают
наружную стенку носа и вращательными движениями тщательно снимают
слущенный эпителий. Тампоны погружают в пробирку с 2 мл фосфатно-
буферного раствора (ФБР). Взятый биоматериал быстро (в течение 1–4 часов)
доставляют
в
лабораторию.
Для получения осадка клеток цилиндрического эпителия пробирки с тампонами в
ФБР энергично встряхивают, тампоны отжимают и удаляют. Полученную
суспензию клеток центрифугируют в течение 5–7 минут при 500–600 g.
Надосадочную жидкость удаляют, осадок суспензируют пастеровской пипеткой в
нескольких каплях остающейся на дне жидкости и используют для приготовления
мазков, которые наносят на тщательно обезжиренные чистые предметные стекла
(последние хранят до использования в этиловом спирте 96%). Стекла
высушивают, маркируют, на каждое из них наносят по 8– 10 капель осадка клеток
и готовят мазки диаметром 6–7 мм, расположенные в шахматном порядке,
которые высушивают при комнатной температуре под вентилятором. Затем мазки
фиксируют, погружая стекла на 10 минут в химически чистый безводный ацетон,
предварительно охлажденный до 2–4ºС. Полученные препараты используют для
окраски
флуоресцирующими
антителами
(ФА).
Мазки окрашивают антителами к вирусам гриппа А (Н1N1), (Н3N2), В,
парагриппа 1, 2 и 3-го типов, РС-вирусу и аденовирусам. С этой целью сухие
препараты ФА регидратируют до исходного объема, указанного на этикетке,
дистиллированной водой, выдерживают 5 минут при комнатной температуре до
полного растворения препарата. После этого проводят центрифугирование
конъюгатов (5–7 минут) при 6000 g, для окраски используют надосадочную
жидкость. Восстановленный конъюгат фасуют по 0,1 мл и хранят при температуре
не выше -1ºС в течение 3–4 месяцев. Для проведения 160 анализов достаточно 1
мл
конъюгата
с
рабочим
разведением
1:3.
Техника
окраски
Готовят рабочее разведение ФА на ФБР в соответствии с указанным на этикетке
(срок хранения – не более 2 недель при +4ºС). Предметные стекла с
фиксированными мазками помещают во влажную камеру, на нижний мазок
наносят каплю флуоресцирующего раствора.
85.
ководствами,
прилагаемыми
к
используемым
тест-системам.
Особенности
клинической
картины
гриппа
и
ОРВИ
Для гриппа характерно эпидемическое и пандемическое распространение
заболевания в зимний период времени. В клинической картине преобладают
симптомы интоксикации. Заболевание начинается остро с высокой температуры,
которая в течение первых суток достигает 39–40º, появляется сильная головная
боль в области лба, глазных яблок, а также боли в мышцах и костях.
Для парагриппа характерно постепенное развитие заболевания с появлением
катаральных явлений и прежде всего слизистых выделений из носа. Симптомы
интоксикации небольшие. Вирус парагриппа обладает преимущественным
тропизмом к эпителию гортани, и поэтому ведущим в клинической картине
является наличие охриплости голоса, что может сопровождаться развитием
стенозирующего ларинготрахеита, приводящего к дыхательной недостаточности.
86.
нки.
При риновирусной инфекции наблюдается преимущественное поражение
слизистой оболочки носа с обильными серозными выделениями из носа и
чиханием. Заболевание протекает чаще всего на фоне нормальной или
субфебрильной температуры со слабо выраженными симптомами интоксикации.
Может встречаться у детей в любом возрасте. Продолжительность заболевания не
более 5–7 дней.
87. Для реовирусной инфекции характерно наличие обычного катара верхних
дыхательных путей с небольшим нарушением общего состояния ребенка и с
присоединением дисфункции кишечника. Обращает на себя внимание гиперемия
лица, инъекция сосудов склер, конъюнктивит, гиперемия миндалин и задней
стенки глотки. Могут быть увеличены шейные лимфатические узлы, печень и
селезенка. Заболевание протекает в течение 8–10 дней и заканчивается
благополучно.
88.ларинготрахеита,
приводящего
к
дыхательной
недостаточности.
При аденовирусной инфекции поражаются различные отделы дыхательных путей
или, реже, желудочно-кишечного тракта. Наиболее типичное течение
аденовирусной инфекции у детей сопровождается одно- и двусторонним
катаральным,
фолликулярным
или
пленчатым
конъюнктивитом,
гранулематозным фарингитом, лихорадкой и увеличением подчелюстных и
заднешейных
лимфатических
узлов.
Выделяют следующие клинические формы аденовирусной инфекции в
зависимости от преимущественного поражения отдела дыхательных путей или
желудочно-кишечного
тракта:
1)
катар
верхних
дыхательных
путей;
2)
пневмонии;
3)
фарингоконъюнктивальная
лихорадка;
4)
тонзиллофарингит;
5)
изолированный
фолликулярный
конъюнктивит;
6)
эпидемический
аденовирусный
кератоконъюнктивит;
7)
мезаденит
аденовирусной
этиологии;
8)
кишечная
форма;
9)
коклюшеподобный
синдром.
У детей раннего возраста довольно часто наблюдается развитие вирусно-
бактериальной пневмонии. В клинической картине заболевания ведущим является
преобладание
экссудативного
компонента
над
общими
симптомами
интоксикации, хотя может наблюдаться и высокая температура. У некоторых
пациентов наблюдается увеличение печени и селезенки.
89.
увеличение
печени.
Микробиологическая
диагностика
коронавирусной инфекции Микробиологическая диагностика коронавирусной
инфекции сходна с диагностикой других острых респираторных заболеваний.
Наиболее распространенными являются метод обнаружения возбудителя в слизи
зева и носа при помощи флюоресцирующих антител и ИФА. Серологическая
диагностика используется для ретроспективной расшифровки этиологии.
Проводится на основе роста титров антител в РСК, РНГА. Клинически
коронавирусную инфекцию диагностировать трудно, так как она не имеет
специфического симптомокомплекса. Дифференциальную диагностику проводят
с
риновирусной
инфекцией
и
вирусными
диареями.
90
корь.
ДЕТСКИХ
ВИРУСНЫХ
ИНФЕКЦИЙ
Микробиологическая диагностика кори Этиология: РНК-содержащий вирус рода
Morbillivirus,
семейства
Paramyxoviridae.
Микробиологическая диагностика кори включает следующие методы:
вирусоскопический,
серологический,
а
также
вирусологический.
Вирусоскопический метод основан на выделении антигена вируса кори из крови,
носоглоточных смывов, секрета конъюнктив, мочи и исследовании методом
иммунофлюоресценции.
Серологический
метод
Противокоревые антитела в крови больного обнаруживаются уже в 1–4-й день
после появления сыпи, концентрация их быстро нарастает и достигает
максимального уровня к 25–30 дню заболевания. Через 1–2 дня после высыпаний
повышается уровень специфических IgM, а через 10 дней IgG. У переболевших
корью антитела сохраняются всю жизнь. Используют РН, РСК, РТГА, РИГА.
Исследование проводят дважды – в начале заболевания (забор крови не позже 3-
го дня высыпания) и повторно через 10–14 дней. Диагностическим является
нарастание титра специфических антител в 4 раза и более. С помощью ряда
методов
определяют
специфические
коревые
антитела
в
крови,
свидетельствующие об остро протекающей инфекции или появляющиеся в более
поздние сроки заболевания. Несмотря на достаточно высокую чувствительность и
специфичность РТГА и РНГА, их существенным недостатком является выявление
в этих реакциях лишь антигемагглютининов, что снижает информативность этих
методов, так как в защите от кори известна роль не только антигемагглютининов,
но
и
антигемолизинов.
В настоящее время для диагностики кори применяют ИФА, который отвечает
всем необходимым требованиям диагностики, улавливая весь спектр антител к
различным антигензначимым белкам вируса. Он обладает высокой
специфичностью, дает возможность получать объективные результаты,
методически прост, что позволяет его широко использовать в лабораторной
практике.
Для экспресс-диагностики кори могут быть реализованы 2 подхода:
1) классический, основанный на обнаружении вирусспецифических антител
класса
М,
являющихся
маркером
текущей
инфекции;
2) метод, позволяющий дифференцировать острую инфекцию от инфекции,
перенесенной
в
прошлом,
основанный
на
определении
авидности
вирусспецифических
антител
класса
G. Преимуществом данного метода является возможность ретроспективной
диагностики кори, так как низкоавидные антитела сохраняются в течение более
длительного срока по сравнению с вирусспецифическими антителами класса М.
Тест-системы для выявления антител класса М и антител к вирусу кори с целью
оценки авидности позволяют, в отличие от ранее существующих методов,
расшифровать этиологию заболевания в течение 3-х часов после поступления
материала в лабораторию при исследовании одного образца сыворотки,
полученной
в
ранние
сроки
инфекции.
Дополнительные
методы
Выделение вируса кори из лейкоцитарной фракции крови, отделяемого зева или
ликвора больных на различных культурах клеток (Vero, Л-41, культурах
лимфобластов мармазетов В-95ф и др.), могут использоваться только в
специализированных
вирусологических
лабораториях.
Диффдиагностика
проводится
с
краснухой,
аденовирусной,
респираторно-синтициальной
инфекциями, скарлатиной, инфекционной эритемой, сывороточной болезнью, а
также медикаментозными и аллергическими высыпаниями.
91
эпид
паратид
ескими
высыпаниями.
Микробиологическая
диагностика
эпидемического
паротита
Этиология: вирус эпидемического паротита (РНК-содер- жащий вирус рода
Rubulavirus
семейства
Paramyxoviridae).
Серологическая
диагностика
IgМ к вирусу эпидпаротита обнаруживаются методом иммуноферментного
анализа с 4 по 28 день от момента появления клинических симптомов. Для
подтверждения (исключения) диагноза требуется исследование одного образца
сыворотки крови, котрую следует забирать на 4–7 день после появления
клинических симптомов заболевания. В редких случаях (забор первого образца
сыворотки крови ранее 4-го дня от момента появления симптомов,
неопределенный результат при исследовании IgM-антител) может потребоваться
забор еще одного образца сыворотки крови, что позволит провести повторное
тестирование IgM-антител и оценить динамику IgG- антител. При необходимости
забора второго образца, учреждение, направившее материал на исследование,
уведомляется
дополнительно.
Забор
материала
Кровь в объеме 0,5–1 мл забирают из пальца или из вены в стерильную
центрифужную пробирку. После образования сгустка, сыворотку следует
отделить центрифугированием, перенести в стерильную промаркированную
пробирку, плотно закрыть и с соблюдением условий холодовой цепи в 3-х
дневный срок направить на исследование в лабораторию. В течение трех суток
после сбора пробы сыворотку допустимо хранить при температуре +4ºС. К каждой
сыворотке
прилагается
заполненная
сопроводительная
форма.
Носоглоточный мазок. Мазок со слизистой носоглотки следует брать стерильным
ватным тампоном, аккуратным (но с достаточным усилием) круговым движением,
стараясь захватить эпителиальные клетки. Ватный тампон помещают в
промаркированную пробирку, содержащую 2–3 мл вирусной транспортной среды
(стерильный фосфатно-солевой буфер с добавлением 100 ед/мл пенициллина, 100
мкг/мл стрептомицина и 2% сыворотки эмбрионов коров). Тщательно закрытую
пробу в день сбора следует отправить с соблюдением условий холодовой цепи в
лабораторию. Если проба отправляется на следующий день после сбора, в течение
суток ее хранят при температуре +4С. Пробы мочи. Предпочтительно собирать
первую
утреннюю порцию мочи, содержащую большее количество эпителиальных
клеток. Мочу в объеме 10–50 мл следует собирать в стерильный
промаркированный флакон, плотно закрыть и в день сбора пробы отправить с
соблюдением
условий
холодовой
цепи
в
лабораторию.
Вирусологическая
диагностика
Вирус эпидпаротита может быть обнаружен (выделен вирус или обнаружена РНК
вируса) в носоглоточных смывах и моче за несколько дней до появления
клинических симптомов (такое обследование возможно в очаге инфекции) и в
первые дни (не позднее 9 дня) со дня появления симптомов.
92. Микробиологическая диагностика краснухи Этиология: вирус краснухи –
Rubivirus (семейство Togaviridae) – РНК-содержащие оболочечные вирусы.
Вирусологический
метод
Материалом для исследования является отделяемое носоглотки и кровь. Вирус
краснухи размножается в культурах клеток амниона человека, почек кроликов и
обезьян и вызывает цитопатический эффект. В других культурах краснуха не
проявляет цитопатического действия. Вирус краснухи агглютинирует эритроциты
птиц (голубей, гусей и др.) и проявляет гемолитическую активность. Для
идентификации вируса используют реакцию радиального гемолиза и РН
гемолитической
активности.
Серологический метод Вирусспецифические сывороточные AT к краснухе у детей