Файл: Сигнальные системы клеток растений.pdf

"включать"  липоксигеназный  каскад  в  хлоропластах.  Эти 

вопросы  составляют  лишь  часть  проблемы  участия  хлоро-

пластов  в  функционировании  липоксигеназнои  сигнальной 

системы и общей сигнальной сети клеток растений.

В  настоящее  время  имеется  достаточно  убедительная 

информация, чтобы считать липоксигеназный путь превра-

щения  мембранных  липидов  самостоятельной  сигнальной 

системой. Одним из признаков сигнальных систем является 

не только передача сигнала в генетический аппарат клеток, 

но  и  его  значительное  усиление  (принцип  фотоумножи-

теля). Взаимодействие одной исходной сигнальной молеку-

лы с рецептором может привести к появлению миллионов 

молекул, определяющих ответную реакцию клетки. Так же 

как в других сигнальных системах, в липоксигеназнои взаи-

модействие первичного сигнала с рецептором плазмалеммы 

активирует  фермент  (фосфолипазу  А

2

),  обеспечивающий 

передачу информации по сигнальной цепи. Накопление сво-

бодных линолеата или линолената (субстратов липоксигеназ), 

вызванное  активацией  фосфолипазы  А,  приводит  к  экс-

прессии генов липоксигеназ [Veronesi et al., 1996], активируя 

тем самым липоксигеназную сигнальную систему.

Одной из особенностей усиления сигналов в липоксиге-

назнои  системе  является  использование  нескольких  видов 

автокаталитических  процессов  (циклов).  В  частности,  это  -

автокаталитическое  усиление  сигнала  с  участием  ионов 

кальция и кальмодулина (рис. 21) [Leshem, 1987]. Образую-

щиеся в плазмалемме из линолената или линолеата гидро-

пероксиформы  этих кислот  могут  выступать  в  роли  ионо-

форов, переносящих ионы кальция снаружи внутрь клетки 

по  градиенту  концентрации  (известно,  что  концентрация 

ионов кальция за пределами плазмалеммы на 2-3 порядка 

выше,  чем  в  цитозоле).  Повышение  концентрации  ионов 

кальция  в  цитозоле  приводит  к  активации  фосфолипаз  А 

при участии кальмодулина и вследствие этого - к еще боль-

шему  освобождению  полиеновых  жирных  кислот  из  фос-

фолипидов.  Второй  механизм  усиления  липоксигеназного 

метаболизма  -  это  опосредованная  жасмонатом  [Jensen  et 
al., 

1997]  или  метилжасмонатом  [Bell,  Mullet,  1991; 1993; 

Melan  et  al.,  1993;  Geerts  et  al.,  1994;  Eiben,  Slusarenko, 
1994;  Avdiushko  et  al.,  1995;  Veronesi  et  al., 

1996]  индукция 

экспрессии генов липоксигеназ (см. рис. 21), приводящая к

Рис. 21. Автокаталитические реакции в липоксигеназнои сиг-

нальной системе [Гречкин, Тарчевский, 1999]

ДСТ - десатураза; ЖК - жасмоновая кислота; КМ - кальмодулин; 

|  КМ-Са]  -  комплекс  кальмодулин-Са;  ЛОГ  -  липоксигеназа;  МеЖК  -

метилжасмонат; ФДК - фитодиеновая кислота; ФЛА

2

 - 

фосфолипаза А

2

повышению скорости оксигенирования линолеата и лино-

лената.  Третий  автокаталитический  цикл  -  индукция  ме-

тилжасмонатом  экспрессии  генов  десатуразы,  катализиру-

ющей превращение линолевой кислоты в линоленовую 
[ Nishiuchi et al., 

1997]. По всей вероятности, это самый про-

тяженный автокаталитический оксилипиновый цикл (см.

рис. 21). Недавно [Seo et al., 2001] был обнаружен еще один 

авто каталитический цикл, заключающийся в индукции ме-

тилжасмонатом экспрессии гена метилтрансферазы  (S-аде-

нозил-метионин:  жасмоновая  кислота  -  карбоксил-метил-

трансферазы),  катализирующей  реакцию  метилирования 

жасмоновой кислоты.

Можно  предположить,  что  промежуточные  и  конечные 

продукты  липоксигеназного  метаболизма  активируют  проте-

инкиназы и, таким образом, осуществляют умножение сигна-

ла и его передачу на геном растительных клеток. К сожале-

нию, сведений об этом в литературе очень мало. Известно, 

что  активировать  мембраносвязанные  протеинкиназы  расте-

ний  способны  оба  типа  продуктов  реакции, катализируемой 

фосфолипазами А

2

, - 

как лизофосфолипиды (особенно, лизо-

фосфатидилхолин  и  лизофосфатидная  кислота),  так  и  нена-

сыщенные жирные кислоты [Scherer, 1996 a, b; Klucis, Polya, 
1987; Lucantoni, Polya, 

1987]. При этом лизофосфатидилглице-

рол,  лизофосфатидилсерин и  лизофосфатидилэтаноламин не 

оказывают активирующего действия на протеинкиназы.

Несмотря  на  то  что  конкретные  молекулярные  меха-

низмы активации генов различными оксилипинами еще не-

достаточно  изучены,  можно  утверждать,  что  они  обладают 

способностью  вызывать  экспрессию  генов,  кодирующих 

белки,  принимающие  участие  в  повышении  устойчивости 

растений к абиогенным стрессорам и в защитных реакциях 

против  патогенов.  Так,  экзогенный  жасмонат  приводит  к 

синтезу  целого  набора  так  называемых  жасмонатиндуциру-

емых  белков  [Mueller-Uri  et  al.,  1988;  Herrmann  et  al.,  1989; 
Sembdner,  Parthier 

1993].  Среди  них  имеются  ингибиторы 

протеиназ 1 и 2, ингибитор трипсина, тионин, напин, круци-

ферин,  вегетативные  запасные  белки,  фенилаланин-аммо-

ний-лиаза,  халконсинтаза,  липоксигеназа,  полифенолокси-

даза и др. Имеются данные [Farmer, Ryan, 1992], что не толь-

ко жасмонат, но и его метаболические предшественники -
13(8)-

гидроперокси-9(г),(Е),15(Х)-октадекатриеновая  кис-

лота и 12-оксо-10,15(г)-фитодиеновая кислота - иницииру-

ют образование стрессовых белков, в частности ингибито-

ров  протеиназ.  Высказывается  мнение  [Parchmann  et  al., 

1997], что 12-оксофитодиеновая кислота, проявляющая да-

же большую активность в индукции защитных белков, чем 

жасмонат, является главным индуктором экспрессии генов

при местной реакции клеток на стрессоры, а за счет жасмо-

ната  и  метилжасмоната  обеспечивается  передача  сигнала  в 

удаленные от места воздействия стрессора ткани и органы 

и формирование в них системного иммунитета. Это мнение 

подтверждается тем, что в отличие от жасмоната 12-оксо-

фитодиеновая кислота не секретируется из культуры расти-

тельных клеток в среду.

Обнаружено также, что летучие продукты липоксигеназ-

ного метаболизма могут индуцировать (в том числе в сосед-

них растениях) защитную реакцию. Так, т/?анс-2-гексеналь 

вызывал  образование  фенилаланин-аммоний-лиазы,  катали-

шрующей  образование  предшественников  растительных  ан-

тибиотиков  -  фенилпропаноидных  фитоалексинов.  Показа-

но [Fukuda et al., 1997], что 4-гидрокси-2-ноненаль 

индуциро-

вал 

синтез  глутатион-Б-трансферазы,  участвующей  в  обез-

вреживании токсичных для растений веществ.

Одно из свойств сигнальных систем - возможность тор-

можения  (прерывания)  прохождения  сигнала  после  того, 

как  он  был  воспринят  клеткой.  Такая  возможность  была 

продемонстрирована  и  в  отношении  липоксигеназной  сиг-

нальной системы. Установлено [Avdiushko et al., 1995], что 

метилжасмонат  активирует  13-гидропероксидлиазу;  это 

приводит не только к усилению продукции бактерицидных 

и фунгицидных гексеналей, но  соответственно к  уменьше-

нию доли метаболического потока, направляемого в сторо-

ну жасмоната и метилжасмоната (эффект автоингибирова-

н ия своего синтеза, проявляющийся, по-видимому, при дос-

тижении  пороговых  концентраций  метилжасмоната).  Ока-

залось, что дивиниловые эфиры - колнелевая и этеролевая 

кислоты  -  могут  ингибировать  активность  липоксигеназ  и 

таким  образом  затруднять  функционирование  липоксиге-

пазной сигнальной системы [Corey et al., 1987]. Колнелевая 

кислота  является  активным  ингибитором  9-липоксигеназы, 
j-

геролевая  кислота  -  13-липоксигеназы  [Гречкин,  неопуб-

ликованные  данные].  Предполагается,  что  ингибирующее 

действие на липоксигеназную активность может также ока-

зывать  эпоксидный  продукт  превращения  9-гидроперокси-

линолената [Sok, Kim, 1989].

Итак, результаты изучения сигнальных функций липок-

сигеназного метаболизма позволяют считать, что ему при-

сущи основные свойства, характерные и для других сиг-

нальных систем, - рецепция, преобразование и умножение 

сигнала, приводящие (при участии протеинкиназ) к экспрес-

сии определенных генов и соответствующему ответу расти-

тельной клетки.

В связи с тем что участие протеинкиназ является важ-

нейшим  звеном  сигнальных  систем  клеток  растений,  осо-

бую значимость приобретают данные о влиянии интермеди-

атов  липоксигеназного  метаболизма  на  фосфорилирование 

белков растений [Каримова и др., 19996]. Показано, что эк-

зогенная  12-гидроксидодеценовая  кислота  (ГДК)  в  неболь-

ших  концентрациях  является  очень  активным  стимулято-

ром  роста,  более  активным,  чем  травматин  и  жасмоновая 

кислота  [Гречкин,  1992].  Поскольку  нельзя  было  исклю-

чить  возможность  участия  ГДК  в  функционировании  сиг-

нальных систем, мы поставили перед собой задачу исследо-

вать ее влияние на фосфорилирование белков, имея в виду, 

что  протеинкиназные  реакции  являются  важнейшим  зве-

ном всех известных сигнальных систем клеток.

ГДК в широком диапазоне концентраций (с максимумом 

при  10"

7

М)  вызывала  значительное  повышение  содержа-

ния радиоактивного фосфата во фракции растворимых бел-

ков. Поскольку при гомогенизации листьев и в реакцион-

ной  смеси  использовались  неспецифические  ингибиторы 

фосфатаз,  эффект  отщепления  фосфата  от  белков  в  про-

цессе обработки материала был минимальным. ГДК оказы-

вала больший стимулирующий эффект на фосфорилирова-

ние белков, чем такой известный эффектор протеинкиназ-

ной активности, как цАМФ. Метилжасмонат также вызы-

вал  большее  фосфорилирование  белков,  чем  цАМФ,  но 

меньшее, чем ГДК.

Результаты  экспериментов  по  разделению  фосфорили-

рованных белков и определению их радиоактивности пока-

зали, что обработка ГДК приводила к значительному повы-

шению  уровня  фосфорилированности  трех  полипептидов 

низкой молекулярной массы (10-24 кДа) и высокомолеку-

лярного полипептида  70 кДа (рис. 22). Из данных рисунка 

следует,  что  уровень  радиоактивности  отдельных полипеп-

тидов (в области 40 кДа) был ниже в варианте с обработкой 

растений ГДК.

Фосфорилирование белков участвует в регуляции мно-

жества процессов [Protein Phosphorylation in Plants,  1996].

Молекулярная масса белков, кДа

Рис. 22. Влияние 12-гидроксидодеценовой кислоты (ГДК) на фос-

форилирование  белков  [Каримова  и  др.,  19996]  гомогената 

трехдневных растений гороха

1 

- 

контроль; 2 - ГДК (0,1  мкМ). Рентгенограммы сканировали  на 

денситографе ИФО-450. Стрелками указаны молекулярные массы бел-

ков, радиоактивность которых подвергалась наибольшим изменениям 

Получены данные о существовании в растениях различных 

типов протеинкиназ и об участии фосфорилирования бел-

ков  в  экспрессии  защитных  генов  после  взаимодействия 

различных патогенов, элиситоров и стрессовых гормонов с 

клетками  растений  [Grab  et  al.,  1985;  Dietrich  et  al.,  1990; 
Farmer et al., 1991; Bolwell et al., 

1996]. О важной роли фос-

форилирования белков в формировании  устойчивости  рас-

тений к патогенам свидетельствуют данные о том, что не-

которые клонированные гены, кодирующие защитные бел-

ки растений, повышающие их устойчивость к инфицирова-

нию патогенами, имели большое сходство с генами, кодиру-

ющими протеинкиназу [Martin et al., 1993]. Если роль в це-

лом  липоксигеназной  системы  в  формировании  защитного 

ответа  растений  достаточно  известна,  то  данные  о  значи-

тельном усилении фосфорилирования белков под влиянием 

промежуточного  продукта  липоксигеназного  метаболизма 

(самой  быстрой  его  ветви)  получены  [Каримова  и  др., 

19996] впервые.

Тот факт, что под влиянием ГДК уровень фосфорилиро-

ванности различных полипептидов изменился в разной сте-

пени  (см.  рис.  22),  свидетельствует  в  пользу  того,  что  она 

может неодинаково  влиять на активность ферментов  (про-

теинкиназ и протеинфосфатаз), определяющих баланс ско-

ростей  фосфорилирования  и  дефосфорилирования  отдель-

ных полипептидов.

Повышение  уровня  общего  фосфорилирования  белков 

под влиянием цАМФ не вызывает удивления, так как из-

вестно  существование  цАМФ-активируемых  протеинки-

наз. Большее фосфорилирование белков под влиянием ме-

тилжасмоната тоже объяснимо, так как известно, что жас-

монат и метилжасмонат могут включать (пусть не полно-

стью) ответную реакцию растений, характерную для меха-

нического  повреждения  тканей  или  инфицирования  пато-

генами.  Известно,  что  в  этих  случаях  активируются  сиг-

нальные системы клеток, в том числе не только циклоаде-

нилатная. Наибольшее фосфорилирование белков под вли-

янием ГДК свидетельствует или о существовании активи-

руемых непосредственно ГДК протеинкиназ, или о вклю-

чении с помощью экзогенной ГДК совокупности сигналь-

ных  систем  клеток,  причем  не  только  циклоаденилатной 

(поскольку цАМФ вызывал меньший эффект), но и каль-

циевой,  и  НАДФ-оксидазной  [Chandra,  Low,  1995],  и,  воз-

можно,  "собственной"  липоксигеназной  системы.  Факты 

такого  влияния  продуктов  фосфолипазных  и  липоксиге-

назных  реакций  обнаружены  у  животных  [Гамалей,  Клю-

бин,  1996]  и  растительных  [Гречкин,  Тарчевский,  1999] 

клеток.

Выявлено [Гречкин и др., 1987], что ГДК является пре-

обладающим  продуктом  метаболизации  гидроперекисей 

линолевой и линоленовой кислот у бобовых. Высокая рост-

стимулирующая активность 12-ГДК обнаружена  в опытах

Рис.  23.  Схема  радиоавто-

графов  электрофореграмм 

белков,  характеризующая 

влияние 

инфицирования 

микоплазмами  и  обработки 

жасмоновой  кислотой  на 

синтез  полипептидов  [Тар-

чевский и др., 19966]

1 

- 

контроль;  2  -  инфици-

рование  микоплазмами; 

3 

- 

об-

работка жасмоновой кислотой. 

Слева  от  столбика  1  -  мо-

лекулярные  массы  маркерных 

белков

с  каллусной  культурой 

сои [Гречкин, 1992; Гречкин и др., 1987].

Как  известно,  уровень  фосфорилированности  белков 

определяется  активностью  не  только  приходной  протеин-

киназной,  но  и  расходной  протеинфосфатазной  реакции.  В 

растениях  обнаружены  высокоактивные  протеинфосфата-

зы нескольких типов [MacKintosh, Cohen, 1989; Vera-Estrella 
et  al.,  1994;  Xing  et  al., 

1996],  которые  могут  контролиро-

ваться  с  помощью  различных  эффекторов.  Насколько 

большой  вклад  вносит  активность  фосфатаз  в  изменение 

уровня  фосфорилированности  полипептидов  под  влиянием 

ГДК, остается невыясненным.

Изменение  спектров  фосфорилированности  белков  яв-

ляется  достаточно  важным  показателем  активности  интер-

медиатов сигнального пути. Чаще изучается их влияние на 

синтез белков. Мы исследовали образование жасмонатин-

дуцированных белков в сопоставлении с влиянием на этот 

процесс  инфицирования  растений  микоплазмами  Achole-
plasma laidlawii 

118 [Тарчевский и др., 19966].

Результатом действия на растения экзогенной жасмоно-

вой кислоты (5 • К)-

5

М) было увеличение поглощения 

14

С-лей-

цина  и  включения  радиоактивной  метки  в  белки.  Относи-

тельная  доля  включения 

14

С  в  белки  от  поглощения  также 

возрастала. При разделении полипептидов с помощью элек-

трофореза  было  обнаружено  индуцированное  жасмонатом 

образование двух новых полипептидов - 38 и 42 кДа (рис. 23).

Если  учесть,  что  появление  нового,  индуцированного 

жасмонатом белка 38 кДа наблюдается и при инфицирова-

нии микоплазмами, то можно сделать вывод, что заражение 

растений включает классический, характерный для биоген-

ного  стресса, катаболический  липидный  сигнальный путь: 

активация фосфолипазы А

2

  —

> освобождение линолената из 

фосфолипидов  мембран  —»  липоксигеназное  превращение 

его в 13-пероксилиноленат -> образование жасмоновой ки-

слоты в результате гидропероксидциклазной и сопутствую-

щих  реакций  [Vick,  Zimmerman,  1987;  Гречкин,  1992;  Тар-

чевский, 1993] —

> 

активация генов устойчивости —> образо-

вание  жасмонатиндуцированных  белков  —»  формирование 

местной и системной устойчивости к патогенам [Neumann et 
al., 1989; Sembdner, Parthier, 1993].

Так как жасмонат вызывал индукцию образования лишь 

одного  из  трех  микоплазмаиндуцированных  белков,  то 

можно предположить, что он является только частью сиг-

нальной системы, приводящей к формированию иммуните-

та растений [Тарчевский и др., 19966].

НАДФН-ОКСИДАЗНАЯ СИГНАЛЬНАЯ СИСТЕМА

Вызванная  действием  элиситоров  на  клетки  растений 

активация  НАДФН-оксидазы  -  стартового  фермента 

НАДФН-оксидазной системы  (рис. 24), является причиной 

интенсивного образования активных форм кислорода - сво-

бодных  радикалов  О

2

и  OFT,  а  также  перекиси  водорода. 

Впервые такой окислительный "взрыв" наблюдали в 1983 г. 
[Doke et al., 

1996] в ответ на инфицирование клубней карто-

феля фитофторой. Позднее обнаружили появление окисли-

тельного  "взрыва"  под  влиянием  различных  патогенных 

грибов,  бактерий,  вирусов,  элиситоров,  механического  по-

вреждения растений.

Обращает на себя внимание преходящий характер окис-

лительного  "взрыва",  проявляющийся  в  относительно  бы-

стром  возврате  концентрации  перекиси  водорода  к  исход-

ному уровню (рис. 25). Это может быть вызвано как сниже-

нием  активности  НАДФН-оксидазы,  в  результате  чего 

уменьшается приходная  часть  баланса перекиси водорода, 

так и  усилением расходной части этого баланса, а именно 

выходом части Н

2

О

2

за пределы клеток (где она использу-

ется в пероксидазных реакциях), разрушением перекиси во-

дорода  каталазой  [Willekens  et  al.,  1997],  потреблением 

части  Н

2

О

2

в  аскорбат-пероксидазной  реакции  аскорбат-

глутатионового цикла (рис. 26).

В образование  активных форм кислорода при действии 

элиситоров, кроме НАДФН-оксидазы, могут вносить вклад 

и другие ферменты, например локализованные в клеточной 

стенке  оксалатоксидаза  [Zhou  et  al.,  1998]  и  пероксидазы, 

активирующиеся  при  щелочном  сдвиге  рН  за  пределами 

плазмалеммы,  который  наблюдается  при  инфицировании 

патогенами  и  действии  элиситоров  [Wojtaszek,  1997].  При 

этом была обнаружена патогениндуцированная секреция