Файл: Сигнальные системы клеток растений.pdf

Рис. 24. Функционирование НАДФН-оксидазной сигнальной си-

стемы

Кат - каталаза; НАДФН-О* - активная форма НАДФН-оксидазы; 

Of - 

супероксиданион-радикал; ПК* - активные формы протеинки- 

наз; СК - салициловая кислота; СОД - супероксиддисмутаза. Осталь-

ные обозначения - см. рис. 6 

Время воздействия элиситора, мин

Рис. 25. Влияние белкового (/) и олигогалактуронатного (2) эли-

ситоров на образование перекиси водорода [Levine et al., 1994]

иероксидазы в клеточные стенки [McLusky et al., 1999]. Оба 

нида ферментов катализируют реакции, в ходе которых об-

разуется перекись водорода. Но главное внимание исследо-

вателей  механизмов  окислительного  "взрыва"  продолжает 

привлекать  НАДФН-оксидаза  плазмалеммы.  Она  представ-

ляет собой гетеродимерный цитохром 6-типа, состоящий из 

субъединиц 22 и 91 кДа. Как и в случаях других сигнальных 

систем,  фермент  (большая  субъединица)  оказался  гомоло-

гичным ферменту животных объектов. Для активации фер-

мента требуется участие еще двух цитоплазматических бел-

ков _ 47 и 67 кДа. При действии патогенов или элиситоров 

первый  из  этих  двух  белков  фосфорилируется,  затем  они 

мигрируют  к  плазмалемме  и  образуют  активный  комплекс 

фермента.

Элиситориндуцируемое  образование  перекиси  водоро-

да  подавляется  ингибиторами  протеинкиназ,  например 

ставроспорином (рис. 27), но активируется ингибиторами 

протеинфосфатазы 2А [Tenhaken et al., 1995], причем по-

Рис. 26. Потребление перекиси водорода с помощью аскорбат-

глутатионового цикла [Vanacker et al., 1998]

АВ - аскорбат восстановленный; АП - аскорбатпероксидаза; ГР -

глутатион-редуктаза;  TSH  -  глутатион  восстановленный;  Г-SS-T  -  ди-

сульфид глутатиона; ДГА - дегидроаскорбат; ДГАР - дегидроаскорбат-

редуктаза; К - каталаза; МДГА - монодегидроаскорбат; МДГАР - мо-

нодегидроаскорбат-редуктаза; ПЛ - плазмалемма; Р - рецептор; СОД -

супероксиддисмутаза

явление  окислительного  "взрыва"  в  этом  случае  происхо-

дит  и  в  отсутствие  элиситора.  Все  это  свидетельствует  о 

важной  роли  фосфорилирования  и  дефосфорилирования 

белков  в  осуществлении  НАДФН-сигнального  пути 
[Levine  et  al.,  1994;  Chandra,  Low,  1995;  Chen  et  al.,  1995; 
Rajasekhar et al., 1999].

Для активации НАДФН-оксидазы требуется также уча-

стие G-белков, что подтверждается в опытах с активатором 
G-

белков мастопараном (рис. 28). Стимулирующее влияние 

фосфолипазы С на активность НАДФН-оксидазы позволя-

ет говорить о взаимодействии НАДФН-оксидазного пути с 

кальциевой сигнальной системой. Это тем более вероятно,

Рис.  27.  Влияние  ставро-

спорина  на  образование 

Н

2

О

2

  [Chandra,  Low,  1995] 

Окислительный 

взрыв 

(накопление  перекиси  водо-

рода)  в  культуре  клеток  сои 

индуцировался 

олигогалак-

туронатным элиситором

Концентрация 

мастопарана, мкМ

Рис.  28.  Влияние  мастопа-

рана на образование Н

2

О

2

в 

культуре клеток петрушки, 

индуцированное  салицило-

вой  кислотой  [Kauss, 
Jeblick, 1995]

1  - 

контроль; 2 - клетки, 

обработанные  салициловой 

кислотой

МДГА

Н

2

О«^    J

Н

2

О 

МД

[

А

У

НАДФН

V   

ДГА

что  у  с убъ единицы 

91 кДа НАДФН-оксида-

{ы  имеются  два  Са

2+

-

связывающих  участка 
| Keller et al., 1998].

Окисление  НАДФН  молекулярным  кислородом 

приводит  к  образованию  супероксид-анионов,  которые  в 

результате 

реакции, 

катализируемой 

супероксиддисмутазой, превращаются в перекись водорода.

О

2

+ НАДФН -^ О~ + НАДФ

+

+ Н

+

; 

■>

Ставроспорин, мкМ

Окислительный "взрыв" - это одна из самых быстрых  

ответных  реакций  кле- 

ток  на  действие  элисито-

ров [Chandra, Low, 1995].

Значительное  повы-

шение  содержания  ак-

тивных  форм  кислорода 

О

2

и Н

2

О

2

оказывает по-

давляющее  действие  на  развитие  патогенных  микроорга-

низмов. В то же время Н

2

О

2

является вторичным посредни-

ком  в  НАДФН-оксидазной  сигнальной  системе.  Недавно 

было установлено, что перекись водорода может активиро-

вать одну из изоформ киназы киназы МАР-киназы [Kovtun 
et  al., 

2000]. Это позволяет сделать предположение о веро-

ятности следующего сигнального пути: Н

2

О

2

 —

> МАРККК —> 

—

> 

МАРКК  —>  МАРК  —>  активация  факторов  регуляции 

транскрипции. В результате осуществляется экспрессия за-

щитных  генов,  синтез  патогениндуцированных  белков 
[Antoniw et al.,1980; Hooft van Huijsduijnen et al., 1986; Raskin, 
1992;  Gaffney  et  al.,  1993;  Delaney  et  al.,  1994;  Levine  et  al., 
1994; Chen et al., 1995; H. Wu et al., 

1997; и др.] и, как следст-

вие, появление локального и системного иммунитета.

Большую  роль  в  функционировании  НАДФН-оксидаз-

ной системы играет салициловая кислота, концентрация ко-

торой  при  действии  патогенов,  элиситоров  или  экзогенной 

перекиси  водорода  повышается  в  десятки  раз  [Leon  et  al., 

1995; Н. Wu et al., 1997; и др.]. Одной из причин "салицило-

вой  вспышки"  является  элиситор-индуцируемое  образова-

ние фенилаланин-аммиак-лиазы, в  результате чего активи-

руется метаболическая цепь фенилаланин 

—> 

коричная кис-

лота —> бензойная кислота —> салициловая кислота. Второй 

причиной может быть быстрая активация гидролазы, осво-

бождающей  салициловую  кислоту  из  О-|3-О-глюкозидсали-

цилата, локализованного в клеточной стенке растений.

Снижение  содержания  салицилата  в  элиситированных 

клетках  через  некоторое  время  после  "салицилатного 

взрыва" объясняется несколькими причинами: его выходом 

из клеток в апопласт и проводящие пути растений, превра-

щением в летучий метилсалицилат и его диффузией в окру-

жающее  растение  воздушное  пространство,  образованием 

глюкозильного эфира салицилата и его отложением в кле-

точные стенки, деградацией салициловой кислоты.

Для  выяснения  функций  салициловой  кислоты  начали 

поиск  салицилатсвязывающих  белков.  Оказалось,  что  та-

ким белком является каталаза [Chen et al., 1993]. Считается, 

что салициловая кислота действует ингибирующе на ката-

лазу  и,  перекрывая  основной  расходный  канал  баланса 

Н

2

О

2

, способствует  ее накоплению.  Некоторые исследова-

тели не разделяют этого мнения о роли салициловой кисло-

ты в НАДФН-оксидазной системе, однако полученные дан-

ные  о  существовании  нескольких  органоспецифичных  изо-

форм  катал  азы,  отличающихся  способностью  ингибиро-

ваться салицилатом, рассеяли эти сомнения. Кстати, было 

обнаружено,  что  салициловая  кислота  -  это  ингибитор  не 

только каталазы, но и целого ряда других железосодержа-

щих  ферментов  [Chen  et  al.,  1997]  -  аскорбат-пероксидаз, 

аконитаз, АСС-оксидазы. Последнее объясняет, почему са-

лициловая  кислота  затормаживает  синтез  этилена  [Leslie, 
Romani, 

1986; 1988]. Имеются результаты, свидетельствую-

щие о существовании активируемых салицилатом МАР-ки-

назах (SIPK) [Zhang, Klessig, 1997; Zhang et al., 1998; Romeis 
et al., 1999; Mikolajczyk et al., 

2000] и о салицилатиндуцируе-

мых рецепторных киназах [Не et al., 1999], которые активи-

ровались  также  патогенами  и  окислительным  стрессом 
ICzernic  et  al., 

1999]. Если иметь в виду, что расположение 

двух гидроксильных групп  у  салициловой кислоты и пере-

киси водорода может быть сходным [Тарчевский и др., 
i 

999], то не исключено, что салицилатактивируемые проте-

инкиназы  являются  и  Н

2

О

2

-

активируемыми  протеинкиназа-

ми [Guyton et al., 1996].

Одним из важных последствий активации патогенами и 

элиситорами  НАДФН-оксидазной  системы  можно  считать 

появление так называемой сверхчувствительности инфици-

рованных и рядом расположенных клеток, что приводит к 

их  гибели  и  появлению  некротических  пятен.  Отмирание 

клеток  -  это  результат  включения  специальной  генетиче-

ской программы. У растений программируемая смерть кле-

ток  (апоптоз)  начала  изучаться  позднее,  чем  у  животных, 

причем  было  обнаружено,  что  механизмы  апоптоза  в  ос-

новном  идентичны  [Самуилов  и  др.,  2000;  Shirasu,  Schulze-
Lefert, 

2000]. Необходимо отметить, что в апоптозе прини-

мают  участие  перекись  водорода  и  салициловая  кислота 

НАДФН-оксидазной  системы  и  некоторые  интермедиаты 

кальциевой,  липоксигеназной,  МАР-киназной  и  NO-синтаз-

ной сигнальных систем.

Ранее [Тарчевский и др., 19966] мы показали, что инфи-

цирование микоплазмой Acholeplasma laidlawii 118 приводит 

к появлению ряда новых белков, синтез одного из которых 

(38 кДа) индуцируется также салицилатом и янтарной кис-

лотой [Тарчевский и др., 1999]. Полученные данные позво-

ляют  утверждать,  что  экзогенные  салицилат  и  сукцинат 

включают тот же сигнальный путь, который вызывает об-

разование части индуцируемых микоплазмами белков. Так 

как  это  мог  быть  НАДФН-оксидазный  путь,  в  котором 

важную роль играет перекись водорода, то это побудило 

нас провести сравнительное изучение действия экзогенных 

салицилата (ингибитора каталазы) и сукцината на каталаз-

ную активность. Оказалось, что оба эти соединения в одних 

и тех же концентрациях тормозят разложение Н

2

О

2

, т.е. яв-

ляются ингибиторами каталазы.

В связи с этим с помощью программы "Oxford molecular 

modelling  program" 

мы  построили  молекулярные  модели 

Н

2

О

2

, салициловой и янтарной кислот. Близость расстояний 

между водородными атомами гидроксильных групп во всех 

трех типах молекул (у перекиси водорода - 2,62 А, салици-

лата - 2,56 А, у одной из возможных конформаций сукцина-

та - 2,64 А) позволяет предполагать, что салициловая и ян-

тарная кислоты могут связываться с активным центром ка-

талазы, выступая в роли конкурентных ингибиторов в реак-

ции разложения перекиси водорода.

Вполне вероятно,  что экзогенная янтарная кислота, по-

добно салициловой, может приводить и к другим эффектам: 

активации супероксиддисмутазы [Rao et al., 1997; Minibayeva 
et al., 

2001] (а это приводит к повышению концентрации пе-

рекиси  водорода),  ингибированию  аконитаз,  пероксидаз  и 

оксидаз [Ruffer et al., 1995].

Не исключено, что освобождаемые из одних клеток са-

лициловая  и  янтарная  кислоты  могут  в  качестве  первич-

ных сигналов взаимодействовать с одним и тем же рецеп-

торным белком плазмалеммы других клеток, изменяя его 

конформацию и "включая" метаболические цепи преобра-

зования и умножения сигнального импульса, завершающи-

еся экспрессией генов и синтезом защитных белков и фи-

тоалексинов.

В  нашей лаборатории  при  исследовании  влияния экзо-

генной  салициловой  кислоты  на  полипептидный  спектр  и 

(качественно,  по  почернению  рентгеновской  пленки)  на 

включение 

|4

С-аминокислот в отдельные полипептиды ока-

залось,  что  салициловая  кислота  очень  сильно  повышала 

содержание полипептида 29 кДа из группы кислых белков, 

а также увеличивала набор щелочных белков, среди кото-

рых  появлялись  новые  полипептиды  11,  38,  42  и  72  кДа 

[Тарчевский и др., 1999].

Полипептиды 72 и 11 кДа можно отнести к белкам с вы-

сокой  скоростью  оборота  (turnover),  отличающимся  интен-

сивным образованием (что определяет их высокую радио-

активность) и быстрым распадом (это приводит к столь низ-

кому содержанию этих полипептидов, что они не проявля-

ются на гелях). Обычно такие соединения играют в обмене 

веществ  роль  оперативных  регуляторов,  достаточно  чутко 

реагирующих  на  изменение  внутриклеточной  или  внешней 

ситуации.

Обращает  на  себя  внимание,  что  салицилатиндуциро-

ванный кислый белок 29 кДа имел очень высокую радиоак-

тивность,  наивысшую  среди  всех  рассматриваемых  поли-

пептидов. В то же время в полипептидах 38 и 42 кДа не об-

наруживалось  высокой  радиоактивности.  Не  исключено, 

что в двух последних случаях салициловая кислота не столь-

ко усиливала синтез этих полипептидов, сколько подавляла 

интенсивность  их  деградации.  Быть  может,  установленный 

ранее  факт  стимулирования  салицилатом  образования  ин-

гибиторов  протеиназ  [Jung  et  al.,  1993]  белковой  природы 

свидетельствует  о  возможности  действия  некоторых  из 

этих ингибиторов не только на протеиназы патогена, но и 

на некоторые протеиназы растения-хозяина.

Нами не установлено случаев полной репрессии салици-

латом образования полипептидов, наблюдалось лишь силь-

ное снижение содержания полипептида 27 кДа.

Электрофоретическое  разделение  белков  показало,  что 

салициловая и янтарная кислоты вызвали сходное измене-

ние  набора  полипептидов.  Эти  данные  позволяют  заклю-

чить, что экзогенные салицилат и сукцинат включают одни 

и те же механизмы экспрессии генов. Особенности измене-

ния  синтеза  различных  белков  под  влиянием  экзогенного 

салицилата  изучались  многими  авторами  [Antoniw,  White, 
1980; Van Loon,  Antoniw, 1982; Pennazio et al., 

1983; и др.]. 

В одной из таких работ [Jung et al., 1993] было обнаружено 

индуцирование  ацетилсалициловой  кислотой  в  растениях 

подсолнечника  синтеза  полипептидов  17  кДа  (из  группы 
PR 

1 белков), 40 кДа (из группы PR 2 белков), 29 и 37 кДа 

(из группы PR 3 белков) и 20 кДа (из группы PR 5 белков), 

причем все они экскретировались в межклеточное прост-

ранство. Для белков группы PR 2 характерна (3-глюканазная 

активность, для группы PR 3 - хитиназная, к белкам груп-

пы PR 5 относят ингибиторы протеиназ. По всей вероятности, 

найденные нами в растениях гороха салицилатиндуцирован-

ные белки 29 и 38 кДа аналогичны белкам группы PR 3 под-

солнечника с близкими молекулярными массами.

Проведенные  исследования  позволяют  считать,  что  ян-

тарная  кислота  является  природным  миметиком  салицило-

вой кислоты, приводя в действие те же механизмы индук-

ции локальной и системной устойчивости растений к пато-

генам.  Вероятно,  этим  и  объясняется  положительное  воз-

действие  обработок  препаратами  янтарной  кислоты  на  ус-

тойчивость  и  продуктивность  сельскохозяйственных  расте-

ний [Тарчевский, 1997].

Как и ожидалось, сходным с салицилатом действием об-

ладает не только янтарная кислота, но и другие ди- и три-

карбоксиловые  органические  кислоты  цикла  Кребса  со 

сходным  с  салицилатом  расположением  гидроксильных 

групп.  Было  показано,  что  салициловая,  янтарная,  яблоч-

ная,  фумаровая  и  лимонная  кислоты  активируют  внекле-

точную пероксидазу, что приводит к значительной интенси-

фикации образования супероксида [Minibayeva et al., 2001]. 

Можно предположить, что освобождение янтарной кисло-

ты и других ди- и трикарбоксиловых органических кислот 

во  внеклеточное  пространство  происходит  при  механиче-

ском повреждении клеток или начинающемся апоптозе. По 

всей вероятности, эти соединения являются одними из тех 

молекулярных "сигналов бедствия", которые включают за-

щитные механизмы в соседних клетках [Тарчевский, 1993].

Роль перекиси водорода и салицилата в растениях не ог-

раничивается  их  участием  в  функционировании  НАДФН-

оксидазной системе клетки, подвергшейся действию элиси-

торов.  Оказалось,  что  они  активируют  программируемую 

смерть  клеток  (апоптоз),  подавляют  развитие  патогенов. 

Кроме того, салициловая кислота может быть одним из фак-

торов  индукции  системного  иммунитета  в  частях  растений, 

удаленных  от  места  инфицирования патогенами.  Это  объ-

ясняется  ее  способностью  транспортироваться  по  флоэме 
[Shulaev  et  al., 

1995]  и  служить  элиситором,  включающим 

сигнальные  системы  клеток.  Некоторые  исследователи  ос-

паривали роль салицилата в качестве индуктора системного

иммунитета, но опыты с использованием трансгенных рас-

тений [Gaffney et al., 1993; Delaney et al., 1994] с привнесен-

ным  геном  бактериальной  салицилатгидроксилазы  (не  спо-

собных  накапливать  салициловую  кислоту  после  инфици-

рования патогенами и осуществлять с ее помощью систем-

ный иммунитет) устранили эти возражения.

Салициловая кислота может метилироваться, а летучий 

метилсалицилат  -  принимать  участие  в  аллелопатических 

взаимоотношениях  в фитоценозах,  наряду  с  летучими  про-

изводными  липоксигеназного  метаболизма  (гексеналями, 

гексенолами, ноненалями, ноненолами, метилжасмонатом) 

и летучими терпеноидными фитоалексинами.

Ознакомление  с  многочисленными  публикациями  поз-

воляет сделать вывод, что окислительный взрыв может иг-

рать одну из главных ролей в появлении разнообразных за-

щитных ответов [Grant, Loake, 2000] и что многие вопросы 

функционирования  НАДФН-оксидазной  сигнальной  систе-

мы остаются еще неизученными.