Файл: Сигнальные системы клеток растений.pdf

NO-

СИНТАЗНАЯ СИГНАЛЬНАЯ СИСТЕМА

Роль N0 в качестве одной из важнейших сигнальных мо-

лекул в растениях была  установлена сравнительно недавно, 

хотя к этому времени NO-сигнальной системе животных и ее 

роли в воспалительных процессах, апоптозе клеток и выра-

ботке иммунитета к патогенам было посвящено очень много 

работ, и это привело к тому, что в 1992 г. NO была признана 

редакцией журнала "Science" "молекулой года". N0 образу-

ется из аргинина, НАДФН и кислорода в результате реакции, 

катализируемой  ферментом  NO-синтазой  [Меньшикова  и 

др.,  2000;  Wendehenne  et  al.,  2001]  -  стартовым  ферментом 
NO-

синтазной сигнальной системы (рис. 29):

2Аргинин + ЗНАДФН + 4О

2

+ ЗН

+

 -> -> 

2Цитруллин + 2NO + ЗНАДФ

+

+ 4Н

2

О.

NO-

синтаза  принадлежит  к  числу  наиболее  сложных 

ферментов,  причем  активность  проявляет  гомодимерная 

форма фермента, а каждый неактивный мономер состоит 

из  редуктазного  (НАДФН-ФАД-ФМН)  и  оксигеназного 
(Fe-

гем) доменов, между которыми распологается кальмо-

дулин. Электроны, участвующие в окислении азота гуани-

динового  радикала  аргинина  и  образовании  NO,  транспор-

тируются из редуктазного в оксигеназный домен (рис. 30). 

Имеется  несколько  изоформ  фермента:  мембраносвязан-

ные кальцийзависимые конститутивные, а также раствори-

мые  кальцийнезависимые  индуктивные  (цитозольные),  вы-

полняющие  роль  первого  фермента  NO-сигнальной  цепи. 

Недавно появилась информация о возможности местонахож-

дения NO-синтаз в пероксисомах клеток растений [Corpas et 
al., 2001].

До сих пор неясно, какая из этих изоформ играет глав-

ную сигнальную роль. Нет данных об участии G-белков в

Рис. 29. Схема функционирования NO-синтазной сигнальной сис-

темы

ГЦ - гуанилатциклаза; СК - салициловая кислота; цАДФР - цикли-

ческая АДФ-рибоза; NO-S - NO-синтаза. Остальные обозначения - см. 

рис. 6

Рис. 30. Структура NO-синтазы [Горрен, Майер, 1998]

/ - 

редуктазный домен; 2 - оксигеназный домен; Apr - остаток ар-

гинина; КМ - кальмодулин; ФАД и ФМН - флавиновые нуклеотиды; 

ВН

4

 - 

птеридин; Fe - гем

передаче  элиситорного  сигнала  от  рецепторов к  NO-син-

тазам.

NO-

синтаза  у  растений  была  обнаружена  практически 

одновременно в нескольких лабораториях [Cueto et al., 1996; 
Leshem,  1996;  Ninnemann,  Maier,  1996;  Noritake  et  al.,  1996]. 

Для нас особый интерес представляют исследования, в ко-

торых была показана роль N0 в абиотических и биотиче-

ских стрессах [Leshem, Haramathy, 1996; Haramathy, Leshem, 
1997;  Huang,  Knopp, 

1998].  Оказалось,  что  активация  NO-

синтазы  происходит  у  устойчивых  к  патогенам  растений 
[Delledone et  al.,  1998;  Klessig  et al., 

2000], а образующийся 

NO 

вызывает  синтез  фитоалексинов  и  защитных  белков 

[Noritake et al., 1996; Dangl, 1998; Delledone et al., 

1998]. Выз-

ванное  патогенами  и  элиситорами  многократное  повыше-

ние содержания NO в тканях растений стали называть "NO-

взрывом",  по  аналогии  с  "окислительным  взрывом" 
[Foissneretal., 2000].

С  1998  г.  начинается  интенсивный  поиск  сходства  и 

различий  в  функционировании  NO-сигнальных  систем  у 

животных  и  растений.  Было  найдено,  что,  так  же  как  у 

животных, в качестве сигнальных посредников между NO 

и геномом выступают цГМФ- и цАДФ-рибоза (см. рис. 29)

Рис.  31.  Структура  диме-

ра  цитоплазматической 

гуанилатциклазы, 

со-

стоящей  из  al-  и  (31-

субъединиц  [Denninger, 
Marietta, 1999] Fe

2+

 - 

гем

[Delledone  et  al.,  1998; 
Durner  et  al.,  1998; 
Hausladen, 

Stamler, 

1998],  что  раститель-

ная  NO-синтаза  инги-

бируется  теми  же  со-

единениями,  что  и 

животная.

цГМФ образуется из ГТФ с помощью растворимой цито-

плазматической гетеродимерной гуанилатциклазы. Одна из 

субъединиц фермента содержит гем, связанный с остатком 

гистидина  (рис.  31).  Активация  гуанилатциклазы  происхо-

дит  при  взаимодействии  NO  с  гемом  [Denninger,  Marietta, 

1999]. Необходимо отметить, что NO-индуцируемое накоп-

Бремя воздействия NO, ч

Рис. 32. Влияние  NO на образование цГМФ в суспензии клеток 

табака [Durner et al., 1998]

I 

- 

клетки, обработанные донором NO; 

2 - 

контроль. Стрелкой по-

казано начало воздействия NO

ление цГМФ имеет преходящий характер (рис. 32). Участие 

цГМФ в сигнальной сети клеток определяется его способ-

ностью  активировать  некоторые  протеинкиназы,  откры-

вать катионные каналы и регулировать активность фосфо-

диэстераз.

В отличие от животных, в NO-синтазной  системе  расте-

ний принимает участие салициловая кислота в качестве по-

средника между N0 и геномом [Durner et al., 1998; Hausladen, 
Stamler,  1998;  McDowell,  Dangl,  2000;  Kumar,  Klessig,  2000]. 

Изучение  с  помощью  иммуноблотинга  синтеза  некоторых 

белков,  индуцируемых  различными  интермедиатами  NO-

синтазной системы, в сочетании с использованием ингиби-

торов  гуанилатциклазы  и  трансгенных растений  с привне-

сенным  бактериальным  геном  салицилат-гидроксилазы  по-

зволил  прийти  к  выводу  о  разветвленной  структуре  этого 

сигнального пути. О первой точке ветвления можно судить 

по  открытию  цГМФ-зависимой  и  независимой  NO-индук-

ции фенилаланин-аммиак-лиазы, о второй - по NO-индуци-

рованному  салицилатзависимому  образованию  матричных 

РНК  белка  PR-1  и  NO-индуцированному  салицилатнезави-

симому  образованию  фенилаланин-аммик-лиазы  [Durner  et 
al., 

1998].  Многократное  накопление  салицилата  под  влия-

нием NO было показано во многих работах, и в связи с этим 

были  оправданы  исследования  взаимосвязей  NO  и  салици-

лата при функционировании NO-синтазной сигнальной сис-

темы.  Существование  NO-индуцированного  цАДФрибоза-

зависимого-  и  цАДФрибозанезависимого  синтеза  белков 
(PR-1) [Klessig  et  al., 

2000]  предполагает  еще  одну  точку 

ветвления  NO-сигнального  пути.  Обслуживает  NO-синтаз-

ную систему, помимо NO-синтазы, еще целый ряд фермен-

тов,  активируемых  различными  интермедиатами  этого  сиг-

нального пути [Klessig et al., 2000]. Монооксид азота активи-

рует  гуанилатциклазу,  катализирующую  образование 

цГМФ, который, в свою очередь, активирует цГМФ-зависи-

мую  протеинкиназу,  а  последняя  -  факторы  регуляции 

транскрипции (NO -> цГМФ -> ПК -> ФРТ -> геном) и каль-

циевые каналы (NO —> цГМФ —» активация кальциевых ка-

налов —> повышение концентрации ионов кальция в цитозо-

ле —> Са-зависимые ПК —> ФРТ -> геном). Салициловая кис-

лота,  накапливающаяся  в  результате  гидролиза  глюкозил-

салицилата или активации ФАЛ, способна активировать

специальную изоформу МАР-киназы (СК —> салицилатин-

дуцируемая  МАР-киназа  -»  ФРТ  ->  геном).  Циклический 

гуанозинмонофосфат  способен  активировать  АДФ-рибо-

зил-циклазу,  катализирующую  образование  цАДФрибозы, 

а  последняя  открывает  кальциевые  каналы  (цГМФ  —» 

цАДФрибоза  —>  повышение  содержания  Са

2+

в  цитозоле  -» 

Са-зависимые ПК —> ФРТ —> геном).

NO 

является  весьма  активным  свободным  радикалом 

(время его жизни in vivo составляет, по-видимому, немно-

гим более 10 с), он способен взаимодействовать с нуклеи-

новыми  кислотами  и  белками  неферментативно  (рис.  33). 

Так, было обнаружено, что у животных NO изменяет ак-

тивность  железорегуляторного  белка  цитоплазмы  (ЖРБ), 

который  связывает  специфический  элемент  матричных 

РНК и поэтому активирует или ингибирует их [Klausner et 
al., 

1997]. Оказалось, что у растений NO оказывал влияние 

на  изоформу  ЖРБ  -  аконитазу,  вызывая  ее  ингибирова-

ние,  что  косвенно  свидетельствует  (наряду  с  существова-

нием протяженных консервативных последовательностей 

у этих ферментов) о возможности влияния NO на процес-

сы  трансляции  непосредственно,  неферментативно,  минуя 

классические и относительно долгие ферментативные сиг-

нальные пути.  По-видимому,  NO  может  влиять и на про-

цессы транскрипции, если  учитывать факт ингибирования 

им  ДНК-связывающей  активности  факторов  регуляции 

транскрипции  при  S-нитрозилировании  определенного  ци-

стеинового остатка. Кроме того, обнаружено, что экзоген-

ный  NO  активировал  ДНК-метилтрансферазу,  что  приво-

дило к повышению содержания метилированных остатков 

цитозина в ДНК и, вследствие этого, препятствовало свя-

зыванию факторов  регуляции транскрипции с промотор-

ными участками генов и переводу их из активных в "мол-

чащие" [Bogdan, 2001].

Еще один возможный неферментативный путь - нитро-

зилирование  монооксидом  азота  S-белков  кальциевых  ка-

налов, что приводит к их открыванию и повышает концен-

трацию ионов кальция в цитозоле [Klausner et al., 1997]. Так 

же как и в случае белков кальциевых каналов, нитрозили-

рование цитозольных S-белков может привести к измене-

нию их конформации, а это, в свою очередь, - к атакуемо-

сти протеазами и изменению времени жизни S-белков.

Рис.  33.  Схема  NO-синтазной  сигнальной  системы,  дополнен-

ная  неферментативным  влиянием  NO  на  метаболические  про-

цессы

ЖРБ - железорегуляторный белок; ПК - протеинкиназа; СИПК -

салицилатиндуцируемая протеинкиназа; ФАЛ - фенилаланин-аммиак-

лиаза; ФРТ - факторы регуляции транскрипции

N0 и образующийся из него пероксинитрит могут окис-

лять тиоловые остатки в белках с образованием сульфено-

вых R-SOH-, сульфиновых R-SO

2

H- 

и сульфоновых R-SO

3

H-

остатков [Bogdan, 2001]. В результате окисления тиоловых 

остатков сульфгидрильные группы могут окисляться до ди-

сульфидных.  Обнаружено,  что  под  влиянием  NO  происхо-

дит разрушение кластеров ZnS в "цинковых пальцах" фак-

торов регуляции транскрипции, и это приводит к повыше-

нию концентрации ионов цинка в цитозоле и ядре.

Неферментативными путями вмешательства N0 в бел-

ковый метаболизм тканей растений могут быть объяснены 

данные  о  влиянии  донора  NO  -  нитропруссида,  на  набор 

белков, полученные в нашей лаборатории В.Г. Яковлевой. 

Введение  в  проростки  гороха  нитропруссида  привело  уже 

через сутки после начала опыта к изменению набора поли-

пептидов  в  растениях.  Исчезли  характерные  для  контроль-

ных растений полипептиды 19 и 30 кДа и появились новые 

с молекулярными массами 32 и 36 кДа.

Проростки гороха уже давно стали для нашей лабора-

тории модельным объектом, с помощью которого мы ис-

следовали влияние на набор и содержание белков салици-

ловой  [Тарчевский  и  др.,  1996а,  б;  1999;  2001],  янтарной 

|Тарчевский  и  др.,  1999],  абсцизовой  [Тарчевский  и  др., 

2001],  жасмоновой  [Тарчевский  и  др.,  1996а,  б]  кислот,  а 

также  инфицирования  микоплазмами  [Тарчевский  и  др., 

1996а, б].  Во всех случаях наблюдаемое изменение набора 

полипептидов в растениях отмечалось лишь через несколько 

дней после начала воздействия того или иного исследуемого 

соединения.  Через  сутки  после  начала  воздействия  на 

проростки  гороха  салициловой  кислоты  не  произошло  из-

менения  набора  полипептидов,  наблюдалось  лишь  некото-

рое  относительное  (по  сравнению  с контрольными расте-

ниями)  повышение  содержания  полипептида  34  кДа,  Бы-

строе  салицилатнезависимое  появление  этого  полипепти-

да, вызванное донором NO нитропруссидом, могло объяс-

няться  неферментативной  активацией  матричной  РНК  с 

помощью монооксида азота.

Ранее [Durner et al., 1998; Klessig et a!., 2000] было уста-

новлено,  что  NO  вызывал  достаточно  быстрое  появление 

двух белков - PR 1 и фенилаланин-аммиак-лиазы - менее 

чем через 24 ч после начала воздействия, но эти результаты

были получены в опытах с использованием более чувстви-

тельного метода иммуноблотинга.

Быстрое  NO-индуцированное  салицилатнезависимое  ис-

чезновение полипептидов 19 и 30 кДа в опытах, проведенных 

в нашей лаборатории, можно было бы объяснить прекраще-

нием их синтеза. Но это происходило бы лишь в том случае, 

если скорость их оборота была бы очень велика. Возможно, 

что непосредственное  взаимодействие  NO  с  этими  белками 

приводило к изменению их конформации и, вследствие это-

го, к быстрой деградации с помощью протеаз.

Примечателен  тот  факт,  что  многократное  повышение 

(всплеск)  содержания  цГМФ,  вызванное  N0,  было  преходя-

щим [Dinner et al., 1998], но синтез NO-индуцированных белков 

продолжался, что свидетельствует о гораздо большем време-

ни жизни более поздних звеньев этого сигнального пути.

Остается неясным, что в NO-синтазой системе является 

рецептором элиситоров, расположены они в плазмалемме 

или цитозоле и принимают ли участие G-белки в качестве 

промежуточного  звена  между  рецептором  и  NO-синтазой? 

Ответа на этот вопрос не содержится ни в статьях журнала 

"Биохимия" [1998. Т. 63, вып. 7], специально посвященного 
N

0, ни в пока еще немногочисленных статьях о сигнальной 

функции NO у растений. Возникает вопрос: не является ли 

рецептором сама молекула фермента NO-синтазы? К этому 

предположению склоняют ее сложность и присутствие в до-

менах регуляторных цистеиновых сайтов, изменение актив-

ности в ответ на различные эффекторы, такие как цитоки-

ны у животных, на фосфорилирование, существование не-

большого  эндогенного  белкового ингибитора,  препятству-

ющего образованию активной димерной формы фермента. 

Интересно, что мутантные мыши, лишенные каждая одной 

из  изоформ  NO-синтазы,  оказались  жизнеспособными,  но 

обнаруживали ряд особенностей в поведении. Кроме того, 

мыши, дефектные по индуцибельной NO-синтазе, были бо-

лее чувствительны к инфекциям [Snyder, 1995].

Интенсивные  исследования  функционирования  NO-син-

тазной  сигнальной  системы  у  растений  должны  в  ближай-

шем будущем привести к новым интересным фактам, каса-

ющимся локализации ферментов этой системы, регуляции 

их  активности,  взаимоотношений  с  другими  сигнальными 

системами и т.д.

ПРОТОННАЯ СИГНАЛЬНАЯ СИСТЕМА

При анализе участия различных сигнальных систем в за-

щитных реакциях против патогенов (образование фитоале-

ксинов и т.д.) необходимо учитывать, что одна из наиболее 

ранних  и  неопровержимо  доказанных  реакций  клеток  на 

действие  элиситоров,  учитываемых  с  помощью  селектив-

ных  электродов  или  флуоресцирующих  рН-индикаторных 

красок,  -  быстрое  преходящее  изменение  в  цитозоле  кон-

центрации протонов за счет входа Н

+

из вакуоли и внекле-

точной среды [Conrath et al., 1991; Mathieu et al., 1991; 1994; 
1996; Horn et al., 1992; Nurnberger et al., 1994; Hahlbrock et al., 
1995;  Amano  et  al.,  1997;  Jabs  et  al.,  1997;  Roos  et  al.,  1998]. 

Трансмембранное  передвижение  протонов  происходит  по 

градиенту концентрации за счет того, что с внешней сторо-

ны плазмалеммы среда более кислая, чем с внутренней, и 

разница может достигать двух единиц рН.

Так, в культуре клеток табака происходили подкисление 

цитозоля и подщелачивание инкубационной среды, вызван-

ное олигогалактуронидами [Mathieu et al., 1991]. Подкисле-

ние цитозоля и подщелачивание среды наблюдались в сус-

пензионных клетках табака не только при действии олиго-

галактуронидов,  но  и  криптогеина  и  других  элиситоров 
[Mathieu et al., 

1996], причем интенсивность и кинетика сдви-

га рН зависела от вида элиситоров, связывающихся с рецеп-

торами плазмалеммы. Механизм преобразования элиситор-

ных сигналов, приводящий к открыванию протонных кана-

лов,  продолжает  оставаться  невыясненным.  Совершенно 

очевидно,  что необходимым  звеном  этого  механизма  явля-

ется  фосфорилирование  белков  Н

+

-

каналов  [Mathieu  et  al., 

1996].  Показано,  что  ингибиторы  протеинкиназ,  например 

стауроспорин,  подавляли  элиситориндуцируемое  подкисле-

ние цитозоля, а ингибитор протеинфосфатаз каликулин А