Файл: Методичка по мікробіології.doc

Теоретичні положення

Вирощування мікроорганізмів на живильних середовищах називається культивуванням, а розвинені мікроорганізми, отримані від тварини, людини, чи рослини, субстрату зовнішнього середовища, – культурою. Розвиток культури мікроорганізмів в рідкому середовищі приводить до утворення суспензії або осаду, плівки, на твердому середовищі – колонії. Культивування за умов визначеної температури (у термостаті) називається інкубацією.

В мікробіологічній практиці широко використовуються як чисті культури мікроорганізмів, так і консорціуми.

Для вивчення фізіолого-біохімічних особливостей розвитку бактерій, а також для встановлення їхньої видової приналежності необхідно виділяти чисті культури, що складаються з мікроорганізмів одного виду.

Консорціуми – змішані чи асоціативні культури, що складаються з 2-х і більш мікроорганізмів, між якими існують різні форми взаємин.

Чиста культура мікроорганізмів одного виду, що виділена з визначеного джерела і відрізняється від інших представників виду незначними змінами, називається штамом. Чиста культура мікроорганізмів, що є потомством однієї єдиної клітини, називається клоном.

Виділення чистої культури проводять поетапно:

• одержання накопичувальної культури;

• виділення чистої культури з ізольованих колоній за методом Коха;

• визначення чистоти культури, що виділена, та вивчення культуральних властивостей;

• ідентифікація мікроорганізмів із різних властивостей: морфологічних, тинкторіальних, біохімічних (ферментативних), антигенних і т.п.

Накопичувальними культурами називаються культури, які складаються переважно з кліток одного виду.

Для одержання мікроорганізмів визначених фізіологічних груп Виноградським запропонована техніка «накопичувальних культур», заснована на використанні елективних (виборчих) середовищ, що забезпечують переважний розвиток визначених бактерій. Інші організми в цих умовах не можуть розмножуватися чи їхній ріст буде дуже незначний.

Внесення кліток мікроорганізмів (зразка ґрунту, проби води) у стерильне живильне середовище для одержання накопичувальної чи чистої культури називається посівом, чи інокуляцією. Для одержання накопичувальних культур кращим матеріалом для інокуляції служать субстрати, у яких відбувається їх природне «збагачення».

Елективні умови передбачають ряд факторів, наприклад, потреба мікроорганізмів у живильному субстраті, відношення до кисню, кислотності середовища, температурі, здібність до спороутворення і т.д.

Підбираючи оптимальний склад живильного середовища та параметри культивування й інокулюючи середовище якими-небудь природними субстратами, що містять різноманітні мікроорганізми, можна одержати накопичувальну культуру організмів, що характеризуються визначеними фізіолого-біохімічними властивостями. З накопичувальних культур виділяють чисту культуру мікроорганізмів.

Чиста культура може бути одержана з окремої колонії або з одної клітини. Основним методом виділення чистих культур є метод Коха. Принцип його полягає в одержанні чистої культури з ізольованої колонії, що розвилася з однієї клітини.

Виділення чистої культури проводять з отриманої накопичувальної культури. Чиста культура може бути одержана механічним роз'єднанням мікроорганізмів методами, що використовують їхні біологічні особливості.

Метод заснований на тому, що за умов нанесення мікроорганізмів з посівного матеріалу на густе середовище окремі клітини будуть закріплюватися (іммобілізуватися) у визначеній крапці твердого середовища і, розмножуючись, давати потомство (клон), що представляє колонію чистої культури мікроорганізмів.

Спочатку вирощують культуру з механічним відокремлюванням клітин мікроорганізмів за посівом на густі живильні середовища в чашки Петрі. Таким чином одержують ізольовані колонії, припускаючи, що вони виросли з однієї клітини, і паралельно вивчають культуральні властивості.

Потім проводять виділення чистої культури з ізольованих колоній на скошений агар. Після цього ідентифікують мікроорганізми з різноманітних властивостей.

Перенесення клітин вирощеної культури мікроорганізмів з одного середовища у свіже стерильне живильне середовище називається пересіванням чи пасируванням. Пасирування – традиційний метод збереження чистої культури мікроорганізмів із дотриманням інтервалів, що залежать від їхнього виду, середовища культивування й умов збереження.

Посів (і пересів) мікроорганізмів проводять із дотриманням визначених правил стерильності – усі маніпуляції проводять біля полум'я пальника (у радіусі 15–20 см) по можливості швидко, щоб не забруднювати культуру сторонніми мікроорганізмами. Не рекомендується робити різкі рухи, ходити біля того, хто виконує посів мікроорганізмів, тому що рух повітря збільшує ймовірність випадкового забруднення культури.

Спосіб посіву в середовище залежить від її консистенції, якості матеріалу, що засівається, і мети дослідження.

Перед посівом необхідно написати на пробірці, колбі чи чашці Петрі назву мікроорганізму і дату посіву.

Виділення чистих культур за методом Коха

Для одержання ізольованих колоній за методом Коха і виділення з них чистих культур аеробних бактерій роблять посів на поверхню твердого живильного середовища у чашки Петрі з накопичувальної культури:

• розплавляють стерильне агаризоване сусло в колбі на водяній бані і розливають його в 3–4 стерильні чашки Петрі;

• мікроорганізми висівають і розподіляють шпателем Дригальского чи петлею, використовуючи техніку виснаженого штриха чи мазка (рис. 7.1) послідовно в декількох чашках Петрі з застиглим твердим агаризованим середовищем;

• спочатку на поверхню середовища першої чашки, використовуючи петлю, наносять краплю розведення накопичувальної культури й обережно розтирають її стерильним скляним шпателем по всій поверхні;

• потім цим же шпателем із клітинами мікроорганізмів, що залишилися на ньому, засівають поверхню другої чашки. Далі цим же шпателем проводять вздовж поверхні третьої чашки Петрі;

• після посіву чашки необхідно перевернути нагору дном і поставити в термостат із температурою, що сприятлива для даного мікроорганізму;

• інкубують посіви звичайно протягом 2–5 днів (у залежності від швидкості росту конкретних мікроорганізмів);

• після інкубації у перших чашках звичайно спостерігається суцільний ріст мікроорганізмів (суцільний «газон»), а в наступних утворюються ізольовані колонії. У випадку засіву за секторами у перших відбувається суцільний ріст, а уздовж наступних штрихів виростуть відособлені колонії мікроорганізмів, що представляють потомство однієї клітини;

• ізольовані колонії відсівають петлею в пробірки на поверхню скошеного густого середовища чи в рідке середовище;

Висів із накопичувальної культури мікроорганізмів, що відносяться до факультативних аеробів чи факультативних анаеробів, для одержання ізольованих колоній роблять методом глибинного посіву в пробірки зі стовпчиком стерильного агару. Стерильною голкою беруть чисту культуру з колоній, одночасно виймають пробку, обпалюють край пробірки і, тримаючи її нагору дном, голкою над пальником роблять прокол до дна.

Виділення чистої культури анаеробних бактерій за методом Коха можливо тільки в умовах, що виключають доступ до них вільного кисню. Анаеробні мікроорганізми можна культивувати у звичайних пробірках і чашках Петрі, поміщаючи їх після посіву в анаеростати – вакуумні скляні ексикатори.

Рис. 7.1. Розсів мікроорганізмів на поверхню твердого середовища:

а – шпатель Дригальського;

б – розсів;

в – ріст мікроорганізмів після розсіву шпателем;

г – ріст мікроорганізмів після розсіву петлею.

Порядок виконання роботи

1. Ознайомитися з технікою поверхневого способу посіву на щільні середовища в чашки Петрі:

• на тверде середовище наносять петлею краплю посівного матеріалу і потім рівномірно розподіляють його на поверхні, користаючись стерильним шпателем Дригальського. За умови узяття рідини петлею вона повинна затягти петлю тонкою плівкою. Піпеткою користаються в тому випадку, коли матеріал засівають у великій кількості чи визначеному об’ємі;

• шпатель виймають із папера і беруть у праву руку;

• відкривають кришку чашки Петрі лівою рукою і вносять у неї шпатель;

• розмазують краплю посівного матеріалу шпателем обертальними рухами на поверхні агарової пластинки (надавлювати шпателем на тверде середовище не треба, тому що можна йому зашкодити);

• з метою економії середовищ і посуду можна користатися однією чашкою, розділивши її на сектори і послідовно засівати їх штрихом (метод виснаженого штриха). Для цього спочатку засівають поверхню першого сектора, а потім послідовно засівають всі інші сектори клітинами, що залишилися на петлі. З кожним наступним штрихом відбувається зменшення кількості клітин, що засіваються;

• переносять шпатель у судину з дезінфікуючим розчином.

2. Ознайомитися з технікою глибинного посіву на тверді середовища в чашки Петрі:

• відкривають стерильну чашку і поміщають петлею чи піпеткою краплю посівного матеріалу на дно чашки;

• розплавляють агаризоване живильне середовище у пробірці чи колбі й охолоджують його до 45–50С;

• обпалюють край пробірки чи колби в полум'ї пальника і виливають середовище (15–20 мл) у чашку Петрі з внесеним посівним матеріалом, дотримуючись правил стерильної роботи;

• розподіляють рівномірно посівний матеріал у живильному середовищі, для чого обережно круговими рухами переміщають чашку Петрі на поверхні столу;

• залишають чашку Петрі на столі до повного затвердіння середовища;

• роблять на чашці напис (число, назва мікроорганізму);

• усі посіви для вирощування мікроорганізмів поміщають у термостат із температурою, що сприятлива для їхнього росту.

3. Ознайомитися з технікою пересівання культур мікроорганізмів, вирощених у рідкому середовищі:

• клітини мікроорганізмів, що виросли в рідкому живильному середовищі відбирають частіше стерильною піпеткою;

• зі стерильного папера виймають градуйовану стерильну піпетку за верхній кінець, беруть піпетку середнім і великим пальцями правої руки, не торкаючись поверхні тієї частини піпетки, що буде вводитися в судину з рідким середовищем;

• беруть у ліву руку пробірку (чи колбу) із культурою мікроорганізму, що вирощена в рідкому середовищі, і тримають її у вертикальному положенні, щоб не замочити пробку;

• відкривають пробку, дотримуючись правил асептики, і вводять піпетку в пробірку;

• набирають у піпетку суспензію мікроорганізму, закривають пробкою пробірку (чи колбу), вносять визначену кількість суспензії у свіже стерильне живильне середовище, дотримуючись правил стерильності;

• після використання піпетку поміщають у судину з дезінфікуючим розчином, не торкаючись нею навколишніх предметів (0,5 %-ний водний розчин хлораміну чи 3–5 %-ний водний розчин фенолу).

4. Ознайомитися з технікою посіву мікроорганізмів, що вирощені на твердому середовищі в пробірках, в іншу пробірку із середовищем:

• запалюють пальник. Посіви проводять над полум'ям пальника, щоб гаряче повітря перешкоджало осадженню мікроорганізмів з навколишнього повітря;

• беруть у праву руку бактеріологічну петлю, за допомогою якої здійснюють посів (петлю тримають як олівець). Стерилізують бактеріологічну петлю в полум'ї пальника, прожарюючи дріт до червоності, і одночасно обпалюють частину утримувача, що примикає до петлі і буде вводитися в пробірку з культурою мікроорганізму. Упродовж прожарювання петлю тримають у полум'ї майже вертикально, щоб весь дріт був розпечений;

• беруть у ліву руку дві пробірки – одну зі стерильним середовищем (далі від себе), іншу – із культурою мікроорганізму;

• не випускаючи бактеріологічної петлі, мізинцем і безіменним пальцем правої руки притискають зовнішні кінці ватяних пробок до долоні і виймають пробки з пробірок. Класти пробки на стіл не можна;

• злегка обпалюють у полум'ї пальника край відкритих пробірок;

• прожарену бактеріологічну петлю вводять у пробірку з культурою мікроорганізму. Щоб не зашкодити клітинам, петлю спочатку прохолоджують, доторкаючись до внутрішньої поверхні пробірки чи до живильного середовища, вільного від клітин мікроорганізмів, і тільки після цього відбирають невелику кількість мікробної маси;

• виймають петлю і вводять її у пробірку зі стерильним живильним середовищем, уникаючи дотику зі стінками пробірки;

• проводять петлею від дна догори зигзагоподібний чи прямий штрих, злегка торкаючись поверхні агару;

• обпалюють ватяні пробки і край пробірок одночасно в полум'ї і закривають обидві пробірки;

• закриту ватною пробкою пробірку з культурою ставлять у штатив, а витягнутий матеріал використовують для готування препарату чи для пересівання культури у свіже середовище;

• обпалюють петлю в полум'ї;

• усі описані маніпуляції варто проводити біля полум'я, за можливістю швидко, щоб не забруднити культуру сторонніми мікроорганізмами.

5. Зобразити необхідні малюнки для кращого засвоєння матеріалу та зробити висновки.

Лабораторна робота № 8

Тема: Методи кількісного обліку мікроорганізмів. Мікробіологічне дослідження мікрофлори повітря

Мета: визначити чисельність мікроорганізмів за методом Коха; користаючись методом прямого рахунку мікробних клітин у рахункових камерах, визначити їхню чисельність; проаналізувати кількісний і якісний склад мікроорганізмів повітря

Матеріали й устаткування: предметні й покривні стекла, барвники, водяна баня зі штативом, бактеріологічна петля, пінцет, спиртівка, 0,1 % розчин агар-агару, окулярний мікрометр, об'єктивний мікрометр, мікроскоп, освітлювач, чисті і накопичувальні добові культури мікроорганізмів (дріжджі), рахункова камера Горяєва, стерильні пробірки, стерильні піпетки на 10 мл та 1–2 мл, колба зі стерильною водою, спирт 96⁰, зразки ґрунту, стерильні живильні середовища (МПА, СА), мікробіологічні пробірки зі стерильною водопровідною водою, шпателі Дригальського, піпетки, скляні палички

Теоретичні положення

Метод Коха – найбільш розповсюджений спосіб кількісного обліку мікроорганізмів на твердих середовищах. Сутність методу полягає в посіві визначеного об’єму досліджуваної суспензії мікроорганізму на тверде середовище в чашки Петрі і наступному підрахунку числа колоній, що виросли. При цьому приймають, що кожна колонія утворюється розмноженням однієї клітини.

Цей метод дозволяє вести облік тільки життєздатних мікроорганізмів. В аналізі беруть стерильно 1 мл суспензії і поміщають у 9 мл стерильної водопровідної води чи фізіологічного розчину, потім роблять ряд послідовних розведень (мал. 8.1).

Ступінь розведення перед посівом визначається передбачуваною кількістю мікроорганізмів в зразку. Ґрунт є середовищем заселення великого числа різноманітних мікроорганізмів. У 1 г ґрунту міститься від 1 до 10 млрд. клітин мікроорганізмів.

Рис. 8.1. Схема готування розведення і посіву суспензії мікроорганізмів

У лабораторній практиці мікробіології немає універсального живильного середовища, на якому розвивалися б усі ґрунтові мікроорганізми, тому результати загальної чисельності мікроорганізмів за методом висіву навіть на найбільш універсальні живильні середовища виходять заниженими.

Метод кількісного обліку мікроорганізмів за допомогою рахункових камер має обмежене застосування, пов'язане з тим, що в цьому випадку виконується облік усіх кліток мікроорганізмів без їхньої диференціації на живі й мертві клітини. Крім того, рахункові камери можуть бути використані лише для підрахунку щодо відносно великих об'єктів – клітин водоростей, дріжджів, спор, грибів, що можна дослідити методом мікроскопії з об'єктивами 8х–40х.

У випадку рухливості клітин препарат незначно підігрівають (чи додають краплю 0,1 % розчину агар-агару). Фіксація і фарбування препаратів призводить до деяких змін розмірів мікробних кліток.