Файл: Методичка по мікробіології.doc

Стерилізація в автоклаві парою під тиском. Найбільш надійний і універсальний метод стерилізації живильних середовищ і матеріалів – стерилізація насиченою парою під тиском вище атмосферного. Підвищений тиск пари створюється у спеціальних герметично закритих товстостінних апаратах (автоклавах). Предмети, що підлягають стерилізації в автоклаві, загортають у папір. Повна стерилізація живильних середовищ забезпечується нагріванням протягом 20 хвилин за умови 120С і надлишкового тиску 1 атм.

Стерилізація кип'ятінням. Стерилізацію металевих інструментів і гумових трубок проводять кип'ятінням. Спори деяких бактерій зберігають життєздатність під час кип'ятіння у дистильованій воді протягом декількох годин, тому рекомендується стерилізацію кип'ятінням проводити у 2 %-ному розчині карбонату натрію протягом 10 хв. У цих умовах спори гинуть.

Стерилізація сухим жаром. Сухим жаром стерилізують в основному скляний посуд. Щоб уникнути зараження предметів, що простерилізовані, із повітря, їх перед стерилізацією загортають в обгортковий папір і виймають із нього тільки перед роботою.

Стерилізація текучою парою. Дробова стерилізація, або тиндалізація. Живильні середовища (молоко, солод, желатин), воду, гумові трубки й інші предмети, що псуються від дії сухого жару, піддають стерилізації текучою парою. Стерилізації текучою парою роблять у кип'ятильнику Коха чи в автоклаві з відкритим вентилем. Воду в них доводять до кипіння, і пара, що утвориться, обтікає об'єкти. Температура живильних середовищ, що стерилізуються, досягає 100С. Нагрівання протягом 30–45 хвилин приводить до загибелі вегетативних клітин бактерій, але спори їх не гинуть. Наступного дня нагрівання повторюють. За цих умов гинуть вегетативні клітини, що розвилися зі спор. Для забезпечення повної стерильності рідину залишають ще на добу і знову повторюють нагрівання. Таку стерилізацію називають дробною, або тиндалізацією.

Пастеризація. В основі пастеризації лежить нагрівання рідин до температури менше 100С. Мета її – знищення безспорових бактерій у рідинах, що втрачають живильні властивості під час кип'ятіння (молоко, пиво, вино й ін.). Здійснюється пастеризація нагріванням рідин при 60С упродовж 30 хвилин, чи при 75С упродовж 15 хвилин, або при 80С упродовж 10 хв.

Холодна стерилізація. Органічні рідини, що не виносять нагрівання, звільняють від бактерій, пропускаючи через стерильні дрібнопористі фільтри. Ці фільтри затримують мікроорганізми, їх називають бактеріальними фільтрами. Бактеріальні фільтри мають різні номери. Фільтри №1 мають середній діаметр пір 0,3 мкм, вони найбільш надійні. Перед уживанням мембранні фільтри стерилізують кип'ятінням. Фільтри поміщають у теплу дистильовану воду і кип'ятять 30 хвилин, змінюючи її 2–3 рази.

Предмети, що виготовлено з термолабільних пластмас, наприклад, центрифужні пробірки, стерилізують ультрафіолетовими променями. Час опромінення встановлюють експериментально. Воно залежить від потужності бактерицидної лампи й відстані між лампою й об'єктом.

Характеристика живильних середовищ для культивування мікроорганізмів різних систематичних груп. Мікроорганізми розрізняються з хімічного складу, типу живлення, дихання, способу одержання енергії, розмноження, стійкості до факторів навколишнього середовища. Живлення є найважливішою функцією мікроорганізмів. Як і всім іншим організмам, їм необхідний набір різних хімічних елементів. Для накопичення, виділення, культивування й збереження мікроорганізмів користуються живильними середовищами. До складу цих середовищ включено живильні речовини, що необхідні у здійсненні обміну між бактеріальною клітиною та середовищем. Обмін речовин мікроорганізмів (бактерій) включає два основних процеси – одержання енергії (енергетичний обмін) і біосинтез речовин клітини (конструктивний обмін). Ці два обміни являють собою різні сторони єдиного метаболізму.

Мікроорганізми повинні бути забезпечені джерелом енергії й одержувати ззовні в необхідних кількостях елементи, що входять у їхній склад для здійснення біосинтезу, розмноження і росту. Це – біогенні (С, О, Н, N); зольні елементи (Р, S, K, Mg, Ca, Fe) і мікроелементи, що стимулюють ріст клітинної маси (у малих дозах) – Zn, Mn, B, Cu, Mo, Co і ін.

У мікробіологічній практиці для вирощування мікроорганізмів використовують різноманітні живильні середовища, які за складом поділяють на природні, або натуральні, напівсинтетичні й синтетичні середовища.

Натуральні середовища складаються з продуктів рослинного й тваринного походження – м'яса, молока, картоплі, моркви, овочевих і фруктових соків, молочнокислої сироватки, відварів, екстрактів, отриманих із природних субстратів.

Прикладами натуральних середовищ можуть служити:

• м’ясопептонний бульйон, що складається з екстракту м'яса (500 г м'яса на 1 л води), 0,5 % NaCl і 1 % пептону (продуктів неповного розкладання білка);

• несхмелене пивне сусло, яке приготовлене на основі солоду (пророслих зерен ячменя) і містить цукри;

• дріжджове середовище, що складається з екстракту дріжджів (7–10 г сухих дріжджів на 1 л води), до якого додають вуглеводи (1–2 %), мінеральні солі К₂НРО₄ (0,1 %); і NaCl (0,5 %);

• картопляне середовище – відвар картоплі (200 г картоплі на 1 л води);

• витяжки з ґрунту й ін.

На натуральних середовищах добре розвиваються багато мікроорганізмів, тому що в таких середовищах є, як правило, усі компоненти, необхідні для їхнього росту.

Для вирощування мікроорганізмів, що використовують органічні форми азоту, найчастіше вживають м’ясопептонні середовища: м’ясопептонний бульйон (МПБ), м’ясопептонний агар (МПА) і м’ясопептонну желатину (МПЖ).

Іноді для культивування мікроорганізмів використовують напівсинтетичні середовища: МПБ із 2 %-ним розчином глюкози; дріжджовий автолізат із солями амонію й вуглеводами у визначеному співвідношенні. Ці середовища широко використовують для одержання вітамінів, антибіотиків, амінокислот та інших продуктів.

Синтетичні середовища, що включають тільки відомі хімічно чисті речовини, у точно зазначених концентраціях: середовище Виноградського для нітрофіксуючих бактерій, глюкозомінеральне середовище для Achromobacter.

Синтетичні середовища бувають простими за складом чи мають великий набір щодо компонентів. Їх широко використовують для вивчення обміну речовин мікроорганізмів.

За призначенням розрізняють елективні й диференційно-діагностичні середовища.

Елективні (виборчі) середовища забезпечують переважний розвиток одного виду чи групи родинних мікроорганізмів: середовище Чапека (для актиноміцетів), середовище Врублевського, Кітта-Тароцци (для анаеробів), МПА з новобіоцином (для сапрофітних стафілокків, стійких до новобіоцину).

Диференційно-діагностичні (індикаторні) середовища, що досить добре дозволяють відрізнити одні види мікроорганізмів від інших: середовище Ендо (для кишкових бактерій), вуглеводні середовища, до складу яких входять різні вуглеводи з індикатором.

З фізичного стану (консистенції) живильні середовища розділяються на:

рідкі (МПБ), густі (МПА), сипучі (розварене пшоно, висівки, що просочені живильним розчином).

Для з'ясування фізико-біологічних особливостей мікроорганізмів, а також для накопичення їхньої біомаси чи продуктів обміну найзручніше застосовувати рідкі середовища.

Напіврідкі середовища готують, додаючи 0,1–0,2 % агар-агару. Агар-агар – рослинний колоїд, що одержують із деяких морських водоростей (складається в основному з полісахаридів, включає азотисті речовини).

Сипучі середовища іноді застосовують у промисловій мікробіології. До них відносяться, наприклад, розварене пшоно, висівки, кварцовий пісок, просочені живильними розчинами.

Густі (тверді) середовища використовують для виділення чистих культур (одержання ізольованих колоній), у діагностичних цілях: опис колоній, встановлення характеру росту на скошеному МПА й ін., для збереження культур, для кількісного обліку мікроорганізмів, визначення їхніх антагоністичних властивостей. Густі середовища готують із рідких, додаючи для згущення агар-агар (1,5–2,5 %), желатину (10–15 %) чи кремнекислий гель. Найчастіше в мікробіологічній практиці для згущення середовищ використовується агар-агар. Це складний полісахарид, більшість мікроорганізмів не використовують його як живильний субстрат. У воді агар-агар утворює гелі, що плавляться при температурі 100С і твердіють при температурі близько 40С. Желатин – білок, що одержують в процесі виварювання кісток і хрящів тварин. Желатин до рідких середовищ додають у кількості 10–15 % (желатиновий гель плавиться при 23–26С).

Порядок виконання роботи

1. Ознайомитися з режимами стерилізації живильних середовищ, посуду, інструментів (додаток 2).

2. Виготовити ватно-марлеві пробки для колб і пробірок різної ємності.

3. Підготувати для стерилізації мікробіологічні пробірки, піпетки, чашки Петрі та інше.

4. Простерилізувати прожарюванням в полум’ї бактеріологічної петлі, голки, гачки.

5. Ознайомитися з рецептурами різних натуральних і синтетичних живильних середовищ.

Рідкі живильні середовища.

1) Солодове (несхмелене пивне) сусло – гарне середовище для деяких молочнокислих і оцтовокислих бактерій, дріжджів, мікроскопічних грибів і інших представників гетеротрофних організмів. Основні компоненти сусла – вуглеводи й азотвмісні речовини.

Несхмелене пивне сусло, що отримують із пивоварного заводу, розбавляють водою до 6–7 за Баллінгом і використовують для культивування багатьох мікроорганізмів. Якщо готове сусло відсутнє, користуються солодовим середовищем, що готують у такий спосіб. Зернівки ячменя пророщують до накльовування, потім висушують їх при температурі 60–70С і мелють на кавовому млині. Нагрівають 1 л води до 50С і, перемішуючи, всипають у неї 250 г меленого солоду. Залишають у воді без нагрівання на 30 хвилин, потім воду нагрівають і підтримують температуру 55–58С. Час від часу з рідини беруть проби на крохмаль (йодна проба). Коли йодна проба покаже повне оцукрювання крохмалю, сусло фільтрують і потім стерилізують тиском ½ атм протягом 30 хвилин (так само стерилізують готове сусло). Варто мати на увазі, що для культивування дріжджів використовують сусло, яке містить 6–8 % цукру, а для молочнокислих бактерій – 8–12 %, тому у суслі потрібно визначити вміст цукру. Сусло стерилізують температурою 115С і тиском 0,5 атм упродовж 30 хв.

2) Картопляне середовище використовується для виділення й культивування спороутворюючих амілолітичних бактерій. Для його готування бульби картоплі ретельно промити, очистити від шкірки і дрібно нарізати. 200 г такої картоплі залити 1 л водопровідної води, прокип'ятити протягом 20–30 хв. Відвар профільтрувати через вату і розлити в судини і простерилізувати (1 годину тиском 1 атм чи 30 хвилин тиском 1,5 атм).

3) Пептонна вода придатна для багатьох організмів. Для її готування до дистильованої води потрібно додати 1 % пептону і 0,5 % кухонної солі. Установити рН 7,2, кип'ятити 30 хвилин, знову перевірити рН. Потім розчин профільтрувати через паперовий фільтр до повної прозорості і стерилізувати протягом 30 хвилин при 120С.

Густі живильні середовища. Для одержання твердого сусла-агару, який є прекрасним середовищем для молочнокислих бактерій і дріжджів, до пивного сусла додають 2 % агару.

Для фільтрування агарових середовищ застосовують ватно-марлевий фільтр. Для його готування скляну лійку покрити марлевою серветкою такої величини, щоб кінці серветки були перекинуті через край лійки назовні, потім на марлю покласти шар гігроскопічної вати і змочити фільтр гарячою дистильованою водою. Агаризоване середовище налити на фільтр у гарячому виді. Процес фільтрації вести в нагрітій водяній бані.

Після фільтрації живильні середовища розливають в судини (колби Ерленмейєра ємністю 250 мл). Наливати треба не вище 2/3 висоти судини. Посуд заздалегідь ретельно миють, висушують, закривають ватно-марлевими пробками, що охороняє середовище від зараження мікроорганізмами, які знаходяться в навколишньому повітрі. Тому пробки повинні бути досить щільними, з рівномірним розподілом волокон вати. Не можна обертати пробки судин, що будуть стерилізуватися в автоклаві, целофаном чи іншими матеріалами, що не пропускають пару. Пара повинна обов'язково проникати через пробку в судину, інакше середовища не нагріються до потрібної температури і не простерилізуються. Посуд необхідно заздалегідь простерилізувати, якщо налиті в нього середовища стерилізують текучою парою чи тиском не більш 0,5 атм. Якщо ж живильні середовища стерилізують під тиском вище 1 атм, то попередня стерилізація посуду необов'язкова.

Середовище з агаром нагрівають на киплячій водяній бані до повного його розплавлення. Якщо передбачається вирощування мікроорганізмів на скошеному агаризованому середовищі в пробірках, то кожну пробірку заповнюють середовищем не більш, ніж на 1/3. Для розливання живильних середовищ користуються лійкою. Потрібно стежити за тим, щоб край пробірок чи флаконів не був змочений живильним середовищем, тому що ватно-марлеві пробки можуть приклеїтись до скла під час стерилізації і будуть важко вийматися, ускладнюючи процес роботи.

Поверх ватно-марлевої пробки на колби й флакони варто надягти паперові ковпачки й підписати назву живильного середовища та дату її готування.

Щоб середовище не підсихало, його скошують після стерилізації, перед посівом. Для цього пробірки з розплавленим на киплячій водяній бані середовищем установлюють у похилому положенні і дають середовищу застигти. Скошена агаризоване середовище не повинно доходити до ватяної пробки на 4–6 см. Середовище, що призначено для культивування бактерій у чашках Петрі, розливають по 15–20 мл у пробірки більшого об’єму, ніж для скошеного агаризованого середовища чи стерилізують у колбах. В останньому випадку до стерилізації агар не розплавляють.

Лабораторна робота № 7

Тема: Культивування мікроорганізмів. Техніка посіву

Мета: засвоїти способи вирощування мікроорганізмів на живильних середовищах, методи виділення чистих культур, техніку посіву культур бактерій на рідкі і тверді живильні середовища, техніку розливу живильних середовищ

Матеріли й устаткування: накопичувальні культури (Streptococcus lactis, Clostridium butiricum, Saccharomyces cereviceae і ін.), зразки ґрунту, чисті культури (Micrococcus lisodeikticus, Streptomyces recifensis), стерильні живильні середовища (МПА, пептонний агар, СА, вівсяний агар, середовище Гаузе, картопляний агар та ін.), водяна баня, електроплитка, стерильні чашки Петрі, мікробіологічні пробірки, шпателі Дригальського, піпетки, скляні палички, бактеріологічні петлі, спирт етиловий, спиртівка