Файл: Методички з Бх на 3 модуль.doc

Матеріали та реактиви: гідролізат нуклеопротеїну, 30% розчин гідроксиду натрію, 7% розчин сульфату міді, газовий пальник, пробірки, піпетки.

Хід роботи. В пробірку вміщують 5 крапель гідролізату нуклеопротеїну, додають 10 крапель розчину гідроксиду натрію, 3-5 крапель розчину сульфату міді (до появи помутніння, яке не зникає), вміст пробірки перемішують, далі нагрівають до кипіння. Забарвлення змінюється. Випадає цегляно-червоний осад Cu₂O.

Робота 4. Молібденова проба на фосфорну кислоту.

Принцип методу. Фосфорна кислота при нагріванні з молібденовим реактивом утворює фосфомолібдат амонію жовтого кольору.

Матеріали та реактиви: гідролізат нуклеопротеїну, молібденовий реактив (розчин 7,5 г молібдату амонію в 100 мл води і 100 мл 32% азотної кислоти, р = 1,2), газовий пальник, пробірки, піпетки.

Хід роботи. В пробірку вміщують 10 крапель молібденового реактиву, додають 5 крапель гідролізату нуклеопротеїну, нагрівають до кипіння.

Забарвлення стає лимонно-жовтим. При охолодженні випадає жовтий кристалічний осад комплексної сполуки - фосфомолібдату амонію.

Клініко-діагностичне значення.

Нуклеїнові кислоти існують в клітинах у вигляді нуклеопротеїнів. При повному гідролізі нуклеопротеїнів утворюються їх складові компоненти: амінокислоти, азотисті основи, пентози, фосфорна кислота. Аналіз ДНК все більше використовується при діагностиці спадкових захворювань.

Тема заняття №3. Біосинтез білка у рибосомах. Дослідження процесів ініціації, елонгації та термінації в синтезі поліпептидного ланцюга. Інгібіторна дія антибіотиків.

Цілі заняття:

• Трактувати поняття білок-синтезуючої системи в рибосомах;

• Пояснювати механізми функціонування білок-синтезуючої системи за участю ферментів активації амінокислот, ініціації, елонгації та термінації біосинтезу поліпептидних ланцюгів;

• Обґрунтувати можливість застосування антибіотиків при інфекційних захворюваннях та при онкологічних процесах, пояснити механізм їх дії.

Теоретичні питання

1. Генетичний (біологічний) код:

• триплетна структура коду;

• властивості коду;

• таблиця генетичного коду.

2. Рибосомальна білок синтезуюча система: компоненти білок синтезуючої системи рибосом.

3. Транспортні РНК.

4. Активація амінокислот.

5. Аміноацил-тРНК-синтетази.

6. Етапи та механізми трансляції:

• ініціація,

• елонгація,

• термінація.

7. Ініціюючі та термінуючі колони мРНК.

8. Роль білкових факторів рибосом в трансляції.

9. Посттрансляційна модифікація пептидних ланцюгів.

10. Регуляція трансляції.

11. Молекулярні механізми контролю трансляції на прикладі біосинтезу глобіну.

12. Вплив фізіологічно активних сполук на процеси трансляції.

13. Антибіотики - інгібітори трансляції у прокаріотів та еукаріотів, їх біомедичне застосування.

14. Біохімічні механізми противірусної дії інтерферонів.

15. Блокування біосинтезу білка дифтерійним токсином (АДФ-рибозилювання факторів трансляції).

Практичні роботи

Завдання 1. Пояснити протипухлинну дію антибіотиків. Чи всі антибіотики можуть бути використаними як протипухлинні?

Завдання 2. Обґрунтуйте механізм дії антибіотиків - інгібіторів ініціації трансляції: стрептоміцину, ауринтрикарбоксилової кислоти.

Завдання 3. Обгрунтуйте механізм дії антибіотиків - інгібіторів елонгації трансляції: аміцетину, хлорамфеніколу, еритроміцину, циклогексиміду, пуроміцину, тетрациклінів.

Завдання 4. Обґрунтуйте механізм дії антибіотиків – інгібіторів термінації трансляції: анізоміцину, хлорамфеніколу, еритроміцину, лінкоцину, стрептоміцину.

Завдання 5. Поясніть механізм дії інтерферонів як противірусних сполук та протипухлинних факторів.

Завдання 6. Поясніть механізм дії дифтерійного токсину.

Завдання 7. Визначення вмісту РНК в лужному гідролізаті нуклеопротеїну.

Принцип методу. Високомолекулярні нуклеїнові кислоти характеризуються смугою світлопоглинання із максимумом при 260 нм. Для лужного гідролізату нуклеопротеїну 1 одиниця екстінкції при 260 нм відповідає 32 мкг РНК/мл за умови вимірюванні в кюветі завтовшки 10 мм.

Матеріали та реактиви: лужний гідролізат нуклеопротеїну, 0,5 М розчин НСlO₄, пробірки, спектрофотометр.

Хід роботи. В спектрофотометричну кювету завтовшки 10 мм вмішують гідролізат нуклеопротеїну і виміряють оптичну густину при 260 нм. Як контроль використовують розчинник - 0,5 М НСlO₄ Вміст РНК розраховують за формулою

С_РНК = Е₂₆₀•32 (мкг/мл).

Клініко-діагностичне значення.

Всі типи РНК відіграють важливу роль в процесі біосинтезу білків. При інтенсивній трансляції загальна кількість РНК в клітині збільшується.

Тема заняття № 7 (для самостійного опрацювання). Аналіз механізмів мутацій, репарацій ДНК. Засвоєння принципів отримання рекомбінантних ДНК, трансгенних білків (семінар).

Цілі заняття:

• Трактувати механізми регуляції експресії генів на рівні транскрипції оперонів, які включають структурні та регуляторні гени, промотор та оператор;

• Трактувати біохімічні механізми генетичних рекомбінацій, ампліфікації генів, особливості регуляції експресії генів у еукаріотів;

• Аналізувати наслідки геномних, хромосомних та генних мутацій, механізми дії найбільш поширених мутагенів, біологічне значення та механізми репарації ДНК (репарація УФ-індукованих генних мутацій); Пояснювати біохімічні та молекулярно-біологічні принципи методів генної інженерії, технології рекомбінантних ДНК, трансплантації генів та отримання гібридних молекул ДНК;

• Пояснювати принципи клонування генів з метою отримання біотехнологічних лікарських засобів.

Теоретичні питання

1. Регуляція експресії генів прокаріотів: схема регуляції за Ф.Жакобом та Ж.Моно.

2. Будова Lac-оперону Е.Со1і: структурні та контрольні гени; промотор, оператор; регуляторний ген та утворення білкових репресорів.

3. Принципи функціонування Lac-оперону: репресія, індукція.

4. Особливості будови та експресії геному еукаріотів.

5. Молекулярна організація ДНК еукаріотів (екзони, інтрони; послідовності, що повторюються).

6. Ядерний хроматин та хромосоми еукаріотів; каріотип людини.

7. Генетичні рекомбінації; транспозони.

8. Рекомбінації геному прокаріотів (трансформація, трансдукція, кон'югація).

9. Процеси рекомбінації у еукаріотів на прикладі утворення генів Н-та L-ланцюгів молекул імуноглобулшів.

10. Ампліфікація генів (гени металотіонеїну, дигідрофолатредуктази).

11. Ланцюгова полімеразна реакція; її біомедичне застосування в діагностиці вірусних та спадкових хвороб людини, ідентифікації особини ("ДНК-діагностика").

12. Регуляція експресії генів еукаріотів на рівні транскрипції, система транскрипційних сигналів - промоторні послідовності, енхансери, атенюатори, сайленсери.

13. Ковалентна модифікація гістонів та НГБ як один з механізмів контролю експресії генів.

14. Фази клітинного циклу еукаріотів.

15. Біохімічні механізми контролю вступу клітини до мітозу; cdc2-кіназа, циклін.

16. Типи мутацій, молекулярні механізми мутацій.

17. Мутагени.

18. Механізми репарації ДНК.

19. Біомедичне значення методів генної інженерії.

20. Технологія трансплантації генів

Практичні роботи

Завдання 1. Ультрафіолетове опромінення шкіри викликає утворення димерів тиміну. При пігментній склеродермі чутливість шкіри до ультрафіолету призводить до раку шкіри. Поясніть молекулярний механізм захворювання. Якого ферменту немає у таких хворих?

Завдання 2. Сполука є мутагеном. Це доведено у дослідах на бактеріальних клітинах, Salmonella, які потребують гістидину для свого росту. Сполука викликає мутацію, в результаті виникають бактеріальні клітини, які можуть рости без гістидину. Які хімічні мутагени Вам відомі?

Завдання 3. Поясніть відрізнення між плазмідами і генами. Як плазміди використовуються в генній інженерії?

Завдання 4. Глікогенози і аглікогенози, хвороби обміну та накопичення ліпідів, неможливість засвоєння фруктози, лактози, порушення обміну амінокислот, анемії та багато інших захворювань є спадковими. Більшість з них є аутосомно-рецесивними, проявляються лише в гомозиготному стані. Поясніть, які є шляхи запобігання розвитку спадкових хвороб.

Завдання 5. Обгрунтуйте, чому безпомилкове копіювання ДНК міліони разів є дуже важливим.

Тема заняття № 4 Дослідження молекулярно-клітинних механізмів дії гормонів білково-нентидної природи та катехоламінів на клітини-мішені.

Цілі заняття:

• Аналізувати поняття про гормони та фізіологічно активні сполуки.

• Проаналізувати класифікацію гормонів, механізми впливу гормонів на клітини-мішені.

• Виявити гормони в досліджуваних розчинах.