Файл: Методички з Бх на 3 модуль.doc

Клініко-діагностичне значення. Подовження протромбінового часу згортання крові спостерігається при гіпофібриногенемії, надлишку антитромбінів, при накопиченні продуктів фібринолізу і деяких молекулярних аномаліях фібриногену. Повне незсідання крові — при гіпергепаринемії і при гострому ДВЗ-синдромі, при дефіциті деяких факторів протромбінового комплексу.

Завдання 2. Визначення вмісту вільного гепарину в крові за методом Сірмаї.

Принцип методу. Метод базується на здатності толуїдинового синього зв'язувати вільний гепарин крові, що призводить до скорочення тромбінового часу.

Хід роботи. В пробірку Відаля №1 (контроль), встановлену на водяну баню, відміряють 0,05 мл ізотонічного розчину натрію хлориду, в №2 (дослідну) — 0,05 мл толуїдинового синього і теж ставлять на водяну баню і в кожну додають по 0,1 мл досліджуваної плазми. Через 30 с додають тромбін по 0,1 мл в кожну і фіксують час згортання крові. Різниця в часі свідчить про кількість вільного гепарину. Норма 16-20 с.

Клініко-діагностичне значення. Найважливіша функція гепарину — антикоагулянтна, яка залежить від антитромбіну ІІІ (АТ-ІІІ) і його доступності для дії гепарину. Нагромадження в плазмі крові білків гострої фази, імунних комплексів та інших компонентів, що мають здатність зв'язувати та інактивувати гепарин, призводить до порушення комплексування АТ-ІІІ до гепарину. Зниження АТ-ІІІ спостерігається при гестозах, хворобах печінки, при інтенсивному лікуванні гепарином, вживанні гормональних контрацептивів. Зменшення гепарину — при інфаркті міокарда, порушенні функції печінки, псоріазі.

Тема заняття № 19. Дослідження біохімічних закономірностей реалізації імунних процесів. Імунодефіцитні стани.

Теоретичні питання

1. Загальна характеристика імунної систем: клітинні та біохімічні компоненти.

2. Природа антигенів та шляхи їх проникнення в організм.

3. Структура різних антигенів:

3.1. Структура високомолекулярних антигенів:

• Антигенна детермінанта (епітоп) полісахаридного антигену

• Епітопи білків-антигенів

3.2 Структура низькомолекулярних антигенів

4. Організація імунної системи:

4.1. Типи лімфоїдних клітин:

• В-лімфоцити

• Т-лімфоцити

4.2. Будова лімфоїдних клітин:

• Білки-рецептори В-лімфоцитів - мембранні форми імуноглобулінів

• Білки-рецептори Т-лімфоцитів

4.3. Функції лімфоїдних клітин:

• Регуляторна функція Т-хелперів, Т-супресорів

• Цитотоксична функція Т-ефекторів - клітинний імунітет.

• Секреторна функція плазматичних клітин.

5. Імуноглобуліни (антитіла):

5.1. Структура антитіл:

• Пептидні ланцюги

• Доменна структура

• Константна ділянка

• Варіабельна ділянка

• Активний центр молекули імуноглобулінів

5.2. Біологічні функції:

• Гуморальний імунітет

5.3. Механізми регуляції синтезу імуноглобулінів.

5.4 Біохімічні характеристики окремих класів імуноглобулінів людини (IgG,IgA,IgM,IgD,IgE).

6. Медіатори та гормони імунної системи:

6.1. Основні класи цитокінів:

• Інтерлейкіни (IL)

• Інтерферони: молекулярні механізми противірусної дії

• Білково-пептидні фактори регуляції росту та проліферації клітин (фактори некрозу пухлин (TNF), колонієстимулюючі фактори росту (КСФ), трансформуючі фактори росту (ТФР))

7. Біохімічні компоненти системи комплементу людини.

7.1 Шляхи активації системи комплементу:

• Класичний механізми активації;

• Альтернативний (пропердиновий) механізм активації

8. Біохімічні механізми імунодефіцитних станів:

• Первинні (спадкові)

• Вторинні імунодефіцити;

• Синдром набутого імунодефіциту людини.

Практичні роботи

Завдання 1. Визначення наявності гістаміну у розчині за специфічною кольоровою реакцією із солями кобальту.

Принцип методу. Гістамін реагує із солями кобальту з утворенням забарвлених комплексних солей.

Хід роботи. 0,01-0,02 г гістаміну розчиняють в 1 мл води, додають 2-3 краплі розчину кобальту нітрату Co(NO₃)₂, або кобальту хлориду СоСl₂ й 1 краплю NaOH. Випадає осад червоно-фіолетового кольору.

Клініко-діагностичне значення. Гістамін є продуктом реакції декарбоксилювання L-гістидину, міститься в гранулах тканинних базофілів. Одним з фізіологічних ефектів гістаміну є участь його в імунологічних реакціях. Збільшення вмісту гістаміна в зоні запалення й ділянках взаємодії антигену з антитілом є одним з патогенетичних механізмів розвитку алергічних і анафілактичних реакцій.

Завдання 2. Визначення активності лізоциму у сироватці крові.

Принцип метода. Показником активності лізоциму служить величина, яка дорівнює різниці між процентом світлопропускання досліджуваної суміші після півторигодинної інкубації та процентом світлопропускання вихідної мікробної культури.

Хід роботи. В пробірку вносять по 0,03 мл досліджуваної сироватки, по і 1,47 мл мікробної культури мікрокока. Обережно струшують, а потім додають по 0,03 мл вітаміну В₆ (вітаміну С) різної концентрації і витримують в термостаті при t=39°C 1,5 години. Після інкубації вимірюють оптичну густину на фотоколориметрі.

Приклад розрахунку: оптична густина культури 20; оптична густина дослідних проб після інкубації — 28; активність лізоциму в сироватці: 28 - 20 = 8 (%)

Клініко-діагностичне значення. Лізоцим (мурамідаза) слини — фермент, вміст якого складає 0,15-0,25 г/л, тобто біля 5% всіх білків слини. Основним джерелом є секрет піднижньощелепних залоз, в привушних залозах його вміст менший. Лізоцим має високі антибактеріальні властивості, оскільки руйнує клітиннустінку бактерій.

Клітини бактерій вкриті жорсткою пористою оболонкою пептидогліканової природи - муреїном. Муреїн побудований з довгих ланцюгів (ниток) полісахаридів, що складаються з N-ацетилглюкозаміну та N-ацетилмурамової кислоти. Полісахаридні ланцюги зшиті між собою білковими (пента- та тетра-пептидними) олігопептидами. Клітинна стінка (муреїн) - це гігантська мішковидна молекула пептидоглікану, що охоплює всю клітину. Лізоцим розщеплює глікозидні зв'язки між Н-ацетилглюкозаміном та N-ацетил-мурамовою кислотою в полісахаридах, і клітина гине.

Змістовий модуль 18. Функціональна та клінічна біохімія органів і тканин

Тема заняття №17 Дослідження процесів біотрансформації ксенобіотиків та ендогенних токсинів. Мікросомальне окислення, цитохром Р-450.

Цілі заняття:

• Трактувати біохімічні механізми функціонування детоксикаційної системи печінки: реакції мікросомального окислення та кон'югації в біотрансформації ксенобіотиків та ендогенних токсинів;

• Пояснювати молекулярні основи генетичного поліморфізму та індуцибельної природи цитохрому Р-450;

• Аналізувати причини розвитку толерантності до лікарських засобів при їх тривалому використанні;

• Пояснювати біохімічні основи розвитку недостатності функцій печінки за умов хімічного, біологічного та радіаційного ураження.

Теоретичні питання

1. Детоксикаційна функція печінки: біотрансформація ксенобіотиків та ендогенних токсинів.

2. Основні стадії біотрансформації чужорідних хімічних сполук в печінці:

• перша стадія - окислювально-відновлювальні та гідролітичні реакції;

• друга стадія - реакції синтезу, або кон'югації.

3. Реакції мікросомального окислення:

• мікросомальні оксигенази (монооксигенази);

• електронотранспортні ланцюги мембран ендоплазматичного ретикулуму;

• цитохром Р-450;

• каталітичний цикл функціонування цитохрому Р-450.

4. Генетичний поліморфізм та індуцибельність біосинтезу цитохрому Р-450.

5. Виникнення та природа розвитку толерантності до лікарських засобів.

6. Реакції кон'югації в гепатоцитах:

• реакції глюкуронування за участю УДФ-глюкуронової кислоти;

• реакції сульфатування за участю 3'-фосфоаденозин-5'-фосфосульфату;

• реакції метилування за участю S-аденозилметіоніну;

• реакції ацетилування за участю ацетил-S-KoA;

• реакції кон'югації з гліцином.

7. Приклади реакцій детоксикації ендогенних токсинів в печінці:

• знешкодження білірубіну - продукту розпаду гему;

• знешкодження скатолу та індолу — продуктів перетворення триптофану.

Практичні роботи

Завдання 1. Виявлення індикану в сечі (проба Обермейера).

Принцип методу. Індикан (тваринний індикан) — калієва сіль індоксилсульфату. Метод ґрунтується на перетворенні індикану в індоксил в процесі кислотного гідролізу ефірного зв'язку сильною мінеральною кислотою (хлористоводнева кислота). Утворений індоксил, в присутності тимолу, окислюється хлоридом заліза до індиголігнону — сполуки рожево-фіолетового кольору.

Хід роботи. До 4 мл сечі додають 2 мл 10% розчину ацетату свинцю [РЬ (СН₃СООН)₂] для осадження жовчних пігментів, солей та інших речовин, що заважають проведенню реакції. Утворений осад відфільтровують. До 2 мл фільтрату додають 1 мл 5% розчину тимолу в 96% етиловому спирті та 2 мл реактиву Обермейера (0,4 г хлориду заліза - FeCl₃, розчиненого в 100 мл хлористоводневої кислоти). Через 10 хв додають 1 мл хлороформу, обережно перемішують і спостерігають за утворенням двох шарів: верхнього - водного та нижнього - хлороформового. Нижній, хлороформовий шар забарвлюється в рожево-фіолетове забарвлення. При вираженій індиканурії інтенсивність забарвлення посилюється до червоно-фіолетового кольору. Це дає змогу робити напівкількісну оцінку результатів.