Файл: Методички з Бх на 3 модуль.doc

З метою подальшого уточнення отриманого результату, нижній хлороформовий шар відбирають піпеткою, переносять в іншу пробірку і додають декілька крапель 20% розчину тіосульфату натрію. За відсутності індикану в сечі забарвлення зникає після додавання тіосульфату натрію. При позитивній реакції, за наявності індикану в сечі, забарвлення шару хлороформу не зникає після додавання тіосульфату натрію.

Клініко-діагностичне значення. Індикан - калієва або натрієва сіль індоксил-сульфату міститься в нормальній сечі в слідових кількостях і не виявляється звичайними лабораторними методами. Гіперіндиканемію та появу великої кількості індикану в сечі (гіперіндиканурію) спостерігають у разі посилення процесів мікробного гниття білків в кишечнику при закрепах, завороті кишки, інших видів кишкової непрохідності або зниженні травної функції шлунково-кишкового тракту.

Посилений розпад білків в тканинах організму при злоякісних новоутвореннях, абсцесах, формуванні гнійних ексудатів, гнійних процесах у легенях, туберкульозі також супроводжується значним утворенням індикану та зростанням його вмісту в сечі.

Завдання 2. Визначення анін-n-гідроксилазної активності мікросом печінки.

1 Етап. Виділення мікросомальної фракції печінки (демонстрація).

2 Етап. Визначення анілін-n-гідроксилазної активності мікросом печінки.

Принцип методу. Швидкість реакцій гідроксилювання в мембранах ендоплазматичного ретикулума печінки значно посилюється при інтоксикації ксенобіотиками, ендогенними токсинами, при вживанні лікарських засобів, під впливом фізіологічно активних сполук (гормонів, вітамінів, тощо).

Метод визначення активності ґрунтується на визначенні вмісту 4-амінофенолу, який утворюється при гідроксилюванні аніліну в монооксигеназному ланцюгу мікросом при участі цитохрому Р-450. При взаємодії 4-амінофенолу з фенолом в присутності карбонату натрію утворюється індофенольний комплекс синього кольору.

Хід роботи. У три пробірки (контрольну, дослідну №1 та дослідну №2) вносять по 0,4 мл трис-НСІ буферу (рН = 7,4), 0,4 мл 0,16 М розчину хлориду магнію, 0,1 мл суспензії мікросом (в контрольну та дослідну №1 вносять мікросоми нормального щура, в дослідну №2 - мікросоми щура, якому попередньо було введено індуктор мікросомального окислення - фенобарбітал), 0,2 мл 0,03 М розчину НАДФН і 0,11 мл свіжоперегнаного 0,03 М розчину аніліну. В контрольну пробу додають 0,5 мл 15% розчину трихлороцтової кислоти (ТХО). Пробірки поміщають на 20 хв в термостат при 37°C.

По закінченні інкубації до дослідної проби додають 0,5 мл 15% розчину ТХО для зупинки реакції. Пробірки центрифугують протягом 10 хв при 700g.

Відбирають з кожної пробірки по 1,0 мл надосадової рідини, додають по 0,5 мл 10% розчину карбонату натрію і по 1,5 мл 2% розчину фенолу, розчиненого в 0,2 М розчині гідроксиду натрію. Вміст пробірок перемішують. Для розвитку забарвлення пробірки поміщають на 30 хв в термостат при 37°С. Екстинкцію дослідних проб вимірюють проти контрольної на фотоелекгроколориметрі при 630 нм (червоний світлофільтр) в кюветі з товщиною шару 10 мм.

Розрахунок анілін-n-гідроксилазної активності. Для розрахунку активності будують калібрувальний графік. Для цього беруть декілька пробірок з різними стандартними розчинами 4-амінофенолу. У всі пробірки додають по 0,5 мл 10% розчину карбонату натрію та по 1,5 мл 2% розчину фенолу в 0,2 М розчині гідроксиду натрію. Вимірюють екстинкцію проб проти контролю і будують калібрувальний графік.

Розрахунок проводять за формулою:

,

де X - гідроксилазна активність в нмоль на 1 мг білка за хвилину; А - вміст 4-амінофенолу в пробі, знайдений по калібрувальному графіку в нмоль; V - об'єм проби, рівний 1,71 мл; m - вміст білка в пробі, в мг.

За результатами проведеного експерименту зробити висновок щодо впливу фенобарбіталу на гідроксилазну активність мікросомальної фракції печінки.

Клініко-діагностичне значення. Порушення детоксикаційної функції печінки проявляється зниженням перетворення (гідроксилювання) та кон'югації ендогенних (білірубін, індол, скатол) та екзогенних (бензойна кислота, спирти, фармакологічні препарати) сполук.

Порушення метаболічних процесів достовірно відображають функціональні тести:

• за змінами активності ферменту - анілін-л-гідроксилази та за антипіриновим тестомоцінюють потужність монооксигеназних реакцій мікросомального окислення (перша стадія детоксикації);

• за тестом з бензойною кислотою оцінюють активність процесів кон'югації (друга стадія детоксикації).

Клінічно важливим прикладом оцінки інтенсивності реакції кон'югації з гліцином є утворення гіпурової кислоти при взаємодії ендогенного гліцину з введеною в оргашзм бензойною кислотою. Визначення кількості екскретованої з сечею гіпурової кислоти після введення per os стандартної дози бензоату натрію, лежить в основі дослідження антитоксичної функції печінки. Цей тест носить назву - проба Квіка.

Тема заняття 18. Дослідження нормальних та патологічних компонентів сечі

Теоретичні питання

1. Внутрішньоклітинна та позаклітинна рідини організму людини.

2. Особливості будови нирок та механізм утворення сечі;

• клубочкова фільтрація;

• реабсорбція та секреція.

• роль активного і пасивного транспорту в реабсорбції речовин у канальцях нирок.

3. Роль норок та легень у підтриманні кислотно-основного балансу організму людини.

4. Роль нирок у регуляції параметрів позаклітинної рідини.

5. Складові компоненти нормальної сечі:

• небілкові азотовмісні компоненти сечі: сечовина, сечова кислота, креатинін, креатин, гіпуронова кислота, індикан, пігменти;

• безазотисті компоненти сечі: глюкоза, кетонові тіла, піруват, мінеральні солі.

6. Об'єм сечі, колір, рН, кількість сечі. Діурез, поліурія, олігоурія, анурія.

7. Роль паратгормону, кальцитоніну, вітамінів в процесі сечоутворення.

8. Патологічні компоненти сечі:

• протеїнурія;

• глюкозурія;

• кетонурія;

• білірубінурія.

9. Характеристика умов утворення каменів в нирках, їх хімічний склад та заходи профілактики.

10. Ренін-ангіотензинова система в регуляції артеріального тиску та водно-сольового обміну в організмі людини.

Практичні роботи

Завдання 1. Визначення білка в сечі.

Принцип методу. Для виявлення білку в сечі найчастіше застосовують реакцію осадження за допомогою сульфосаліцилової кислоти.

Хід роботи. У пробірку №1 і №2 наливають відповідно по 2 мл сечі нормальної і патологічної. В обидві дбають по 5 крапель 20% розчину сульфосаліцилової кислоти. За наявності білка в сечі утвориться білий осад або муть.

Клініко-діагностичне значення. Сеча здорової людини практично не містиь білка. Білок з'являється в сечі (альбумінурія) при порушенні фільтраційної мембрани, при серцевій декомпенсації, інколи під час вагітності; при гіпертонії та інфекційних захворюваннях нирок.

Завдання 2. Визначення глюкози в сечі.

Принцип методу. Метод базується на властивості глюкози при нагріванні окислюватись з утворенням оксиду міді Ічервоного кольору.

Хід роботи. До сечі додають 10 крапель реактиву Фелінга. Переміщують. Нагрівають до кипіння. При наявності глюкози утворюється жовтий або червоний осад. Колір осаду залежить від вмісту глюкози в сечі.

Клініко-діагностичне значення. У нормі концентрація глюкози в крові становить 2,77-5,55 ммоль/л. Якісне та кількісне визначення цукру в крові та сечі має важливе клініко-діагностичне значення. В сечі вміст глюкози менше 2,77 ммоль/л. Підвищення глюкози в сечі спостерігається при всіх випадках гіперглікемії — це глюкозурія. Вона буває при цукровому діабеті, аліментарній гіперглікемії, акромегалії, синдромі Іценка-Кушінга тощо.

Завдання 3. Визначення кетонових тіл в сечі — проба Легаля.

Принцип методу. Ацетон і ацетооцтова кислота з нітропрусидом натрію в лужному середовищ утворюють продукти реакції, зафарбовані в червоний колір.

Хід роботи. В дві пробірки наливають по 0,5 мл сечі (норма і патологія), додають по 0,5 мл розчину гідроксиду натрію і по 5-7 крапель нітропрусиду натрію. Поява вишневого кольору свідчить про вміст кетонів у сечі.

Клініко-діагностичне значення. У нормі за добу виділяється 20 - 40 мг кетонових тіл. Збільшення кількості кетонових тіл у крові (кетонемія) і сечі (кетонурія) спостерігаються при цукровому діабеті, дефіциті вуглеводів у харчуванні, тиреотоксикозі, ураженні печінки, важких інтоксикаціях.

Завдання 4. Визначення жовчних пігментів у сечі реакцією Гмеліна.

Принцип методу заснований на окисленні жовчних пігментів концентрованою азотною кислотою і появі різнозабарвлених продуктів окислення. Цей метод дає можливість визначити білірубін в розведеному розчині 1:80000.

Хід роботи. В пробірку наливають 1-2 мл концентрованої азотної кислоти і обережно по стінці добавляють 1-2 мл досліджуваної сечі. При наявності в сечі жовчних пігментів внизу пробірки появляться кольорові кільця, характерні для окислених жовчних пігментів.

Клініко-діагностичне значення. Жовчні пігменти — білірубін, білівердин і уробілін з'являються в сечі лише при патології: ураження печінки, жовчовивідних шляхів. Норма білірубіну в крові здорових людей — 8,5-20,5 мкмоль/л.

Завдання 5. Визначення уробіліну в сечі за реакцією Богомолова.

Принцип методу. Уробілін утворює із сульфатом міді забарвлену сполуку, яка добре екстрагується хлороформом.

Хід роботи. В дві пробірки наливають по 2-З мл нормальної і досліджуваної сечі, додають по 2-3 краплі розчину сульфату міді і по 0,5 мл хлороформу. Кілька разів енергійно струшують. У присутності уробіліну хлороформ забарвлюється у рожевий колір у нижній частині пробірки.