Файл: Химия.doc

3. Гидролазы.Ферменты этого класса обеспечивают расщепление внутримолекулярных связей органических соединений при участии воды. К этому классу принадлежит большая группа ферментов, в том числе почти все энзимы желудочно-кишечного тракта: эстеразы, фосфатазы, пептидазы и др.

4. Лиазы.К этому классу принадлежат ферменты, которые катализируют обратимые реакции отщепления разных групп от субстратов негидролитическим путем. Расщепление идет по связи С-С, С-N, С-О и т.д. К таким ферментам принадлежат, например, декарбоксилазы, которые отщепляют СО₂от карбоновых кислот.

5. Изомеразы.Эти ферменты катализируют разные типы реакций изомеризации. Они также катализируют процессы внутримолекулярнных превращений: переноса водорода, фосфатных и ацильных групп, изменения пространственного расположения атомных группировок, перемещения двойных связей и т.д. Например,L-изомеры превращаются вD-изомеры, глюкоза – в фруктозу и т.п.

6. Лигазы, илисинтетазы. Ферменты этого класса принимают участие во всех реакциях синтеза разных соединений. Они ускоряют реакции образования органических соединений. Одним из таких природных донаторов энергии является аденозинтрифосфат (АТФ). Энергия, которая выделяется при отщеплении остатков фосфорной кислоты, используется для процессов биосинтеза.

В пищевой промышленности ферменты используются для получения продуктов с заданными свойствами. При этом могут использоваться микробные ферменты; ферменты, выделенные из некоторых органов, например, из печени, поджелудочной железы, желудка. Более удобным и эффективным является использование иммобилизированных ферментов.

Иммобилизация ферментов – это включение объекта (фермента) в изолированную фазу, которая отделена от фазы свободного раствора, но способна обмениваться с ней молекулами.

Иммобилизированные ферменты получают путем связывания с носителями растворимых ферментов или клеток, которые имеют ферментативную активность, т.е. делают сорбцию фермента на носители и включения в структуру носителей-гелей.

Иммобилизация приближает условия их функционирования к природному.

Преимущество их использования состоит в том, что их можно удалять из реакционной среды, т.е. контролировать ход реакции и многоразово его использовать. Использование иммобилизированных ферментов позволяет осуществлять каждый процесс непрерывно, пропуская раствор субстратов через реакторы с иммобилизированными ферментами.

Иммобилизированные ферменты имеют высокую каталитическую активность, ее можно изменять, изменяя способ связывания и вид носителя. Продукты реакции не загрязняются кристаллическими ферментами.

С помощью иммобилизированных ферментов получают аминокислоты, ароматические кислоты, сахара, органические растворители, антибиотики, их используют для очистки сточных вод и водоемов.

В промышленности применяют ферменты микробного происхождения: протеолитические, липолитические, амилолитические, гидролазы, которые расщепляют пектин, целлюлозу и гемицеллюлозу.

Практическое занятие № 2 «Классификация ферментов; строение коферментов и простетических групп их каталитических центров» Вопросы к семинарскому занятию:

1. Роль ферментов в организме.

2. Строение ферментов и их активных центров.

3. Свойства ферментов.

4. Влияние физических и химических факторов на активность ферментов.

5. Специфичность действия ферментов. Виды специфичности.

6. Номенклатура и классификация ферментов.

7. Классы ферментов.

8. Процессы пищевых производств, которые основаны на действии ферментов.

9. Ферменты консервной промышленности.

10. Ферменты мясоперерабатывающей промышленности.

11. Ферменты крахмалопатоковой промышленности.

Лабораторная работа № 2 «Изучение механизма действия витаминзависимых ферментов на примере оксидоредуктаз»

Присутствие окислительно-восстановительных ферментов в растительных и животных тканях и биологических жидкостях может быть обнаружено по их действию на соответствующие субстраты.

Задание 1. Окисление тирозина молекулярным кислород в присутствии тирозиназы (катехолоксидазы).Тирозиназа относится к группе оксидаз и катализирует окисление одноатомных и многоатомных фенолов (орто-дифенолы) и родственных им соединений (групповая специфичность) кислородом воздуха. По химической природе тирозиназа является металлопротеидом, содержащим медь в количестве 0,20-0,25%. Медь является необходимым компонентом активного центра фермента и действует как переносчик электронов в процессе окисления и восстановления. Тирозиназа находится в отдельных тканях и органах и широко распространена в растениях и грибах.

В организме животных и человека тирозиназа катализирует превращение адреналина в физиологически неактивный пигмент адренохром. Последний, конденсируясь, превращается в бурый пигмент меланин. Бронзовый цвет кожи при заболевании надпочечников (аддисонова болезнь) обусловлен образованием избыточного количества меланина.

Ход работы. Мелкоизмельченный картофель в количестве 0,5-1 г растирают в фарфоровой ступке с 3 мл дистиллированной воды и фильтруют через два слоя марли. Фильтрат содержит фермент тирозиназу.

В две пробирки наливают по 1 мл вытяжки из картофеля, содержащей фермент тирозиназу. Содержимое одной пробирки кипятят 1-2 минуты и охлаждают в стакане с холодной водой. В обе пробирки добавляют по 0,5 мл насыщенного раствора тирозина, перемешивают и помещают в водяную баню при температуре 40-45 ^оС. Каждые 5 минут пробирки вынимают и содержимое их сильно встряхивают для лучшего соприкосновения жидкости в пробирках с воздухом. Жидкость в пробирке с активным ферментом постепенно принимает сначала розовую, красную, а через 1-2 часа – бурую и черную окраску. В контрольной пробе с прокипяченной вытяжкой цвет жидкости не изменяется (почему?).

Реакция обусловлена окислением тирозина кислородом воздуха и протекает благодаря каталитическому действию тирозиназы. В процессе окисления из тирозина образуется красный пигмент галахром, который затем превращается в темный пигмент, родственный естественным меланинам.

Задание 2. Окисление формальдегида метиленовой синью в присутствии альдегиддегидрогеназы (ксантиноксидазы) молока. Альдегиддегидрогеназа, или ксантиноксидаза, относится к аэробным дегидрогеназам (акцептором электронов и протонов служит кислород) и катализирует окисление гидратированной формы гипоксантина в ксантин, а также ксантина в мочевую кислоту. По химической природе ксантиноксидаза является флавопротеидом, содержащим металл молибден. В отличие от оксидаз геминовой природы (цитохромоксидаза) и тирозиназы, катализирующих окисление субстрата молекулярным кислородом с образованием молекул воды, при действии на субстрат оксидаз флавиновой природы конечным продуктом реакции является перекись водорода.

При определенных условиях альдегиддегидрогеназа может передавать электроны не только кислороду воздуха, но и цитохромной системе. В анаэробных условиях фермент способен окислять субстрат за счет восстановления метиленовой сини и других красок, например, индиго, индофенола и др.

Ксантиноксидаза содержится в молоке, печени, а также в других тканях растительного и животного происхождения.

Ход работы. В две пробирки наливают по 1 мл свежего молока, в третью – прокипяченного и охлажденного молока. В первую и третью пробирки добавляют по 1 капле смеси 0,4%-ного раствора формальдегида и 0,02%-ного раствора метиленовой сини, во вторую – 1 каплю 0,02%-ного водного раствора метиленовой сини. Жидкость во всех трех пробирках должна быть окрашена одинаково в негустой голубой цвет. Во все три пробирки добавляют по 5 капель вазелинового масла для предохранения жидкости от соприкосновения с кислородом воздуха (создание анаэробных условий) и помещают в водяную баню при температуре 40^оС. Через некоторое время жидкость в первой пробирке обесцвечивается.

Реакция обусловлена восстановлением метиленовой сини в лейкоформу за счет окисления формальдегида в муравьиную кислоту и протекает благодаря каталитическому действию фермента альдегиддегидрогеназы.

Вследствие отсутствия активного фермента в прокипяченной пробе (третья пробирка) и субстрата в одной из некипяченых проб (вторая пробирка) обесцвечивания метиленового синего не происходит. Реакцией на альдегиддегидрогеназу можно отличить сырое молоко от кипяченого.

Задание 3. Окисление пирогаллола перекисью водорода в присутствии пероксидазы. Пероксидазами называются ферменты, которые катализируют окисление некоторых фенолов, полифенолов и ароматических аминов перекисью водорода или органическими перекисями.

Участвующая в реакции перекись водорода образуется в организме в результате действия некоторых оксидаз флавиновой природы (ксантиноксидаза). Органические перекиси возникают при окислении кислородом воздуха легко окисляющихся веществ, например, терпенов, каротиноидов и непредельных жирных кислот.

По химической природе пероксидаза является геминовым ферментом (в состав простетической группы входит железопорфирин) и содержит одну гематиновую (Fe³⁺) группу на молекулу фермента. Пероксидаза широко распространена почти во всех растительных клетках. В организме человека и животных слабой пероксидазной активностью обладает гемоглобин, миоглобин, цитохромы.

Ход работы. В четыре пронумерованные пробирки наливают по 0,5 мл 2%-ного водного раствора пирогаллола и добавляют: в первую – 0,5 мл свежей вытяжки из хрена (содержит фермент пероксидазу) и 2 капли 1%-ного раствора перекиси водорода, во вторую – 0,5 мл прокипяченной и охлажденной вытяжки из хрена и 2 капли 1%-ного раствора перекиси водорода, в третью – 0,5 мл дистиллированной воды и 2 капли 1%-ного раствора перекиси водорода, в четвертую – 0,5 мл свежей вытяжки из хрена. Содержимое всех пробирок взбалтывают и наблюдают, что красный (возможно желто-бурый) осадок пурпургаллина образуется только в той пробирке (первая пробирка), где присутствуют донатор (пирогаллол) и акцептор водорода (перекись водорода) и активный фермент – пероксидаза.

Реакция обусловлена окислением пирогаллола перекисью водорода с образованием пурпургаллина – нерастворимого вещества красного цвета.

Задание 4. Разложение перекиси водорода каталазой крови. Каталаза катализирует разложение перекиси водорода на молекулярный кислород и воду. При этом одна молекула перекиси водорода окисляется и служит донором электронов, а другая восстанавливается и является акцептором электронов.

По химической природе каталаза является геминовым ферментом и содержит четыре гематиновые группы на молекулу фермента. Каталаза содержится во всех тканях и жидкостях организма, в большом количестве находится в эритроцитах. Биологическая роль каталазы заключается в обезвреживании перекиси водорода путем разрушения ее на воду и молекулярный кислород. Следует отметить, что если перекись водорода не удаляется из сферы окислительно-восстановительной реакции, то действие флавиновых оксидаз прекращается. В разрушении перекиси водорода принимает участие и пероксидаза.