Файл: Ферменты.doc

1,3 - дифосфоглицериновая 3 - фосфоглицериновая

кислота кислота

АТФ участвует в фосфорилировании углеводов - в образовании метаболически активных форм сахаров - их фосфорных эфиров, например, из глюкозы путем фосфорилирования образуется глюкозо–6–фосфат под действием фермента гексокиназы:

Мg²⁺

АТФ + L-D-глюкоза АДФ + L-D-глюкоза- 6 - фосфат

гексокиназа

Глюкозо–6–фосфат превращается во фруктозо–6–фосфат под действием фермента фосфоглюкоизомеразы. Далее фруктозо–6–фосфат фосфорилируется при участии еще одной молекулы АТФ и фермента фосфофруктокиназы во фруктозо–1,6–дифосфат.

Принцип метода. Если в начале брожения и в процессе взять одинаковые пробы и проделать качественную реакцию (молибденовую) на фосфорную кислоту, то окажется,что интенсивность образующейся синей окраски в пробах убывает от первой к последней. Это обусловлено тем, что неорганический фосфат постепенно поглощается и количество его в среде уменьшается.

Количество же связанного фосфата в органической форме (АТФ, глюкозо–6–фосфат, фруктозо–6–фосфат и др.) увеличивается. Если пробы подвергнуть гидролизу, то органические соединения фосфора разрушаются и количество неорганического фосфата во всех пробирках будет равно начальной величине – окраска в пробирках будет одинаковой.

Химизм молибденовой реакции на фосфорную кислоту заключается в образовании комплексного соединения 12 молибдофосфата аммония (осадок желтого цвета), которое при добавлении аскорбиновой кислоты восстанавливается с образованием молибденовой сини (смесь окислов молибдена).

Молибденовая реакция на фосфорную кислоту:

РО₄^–3+ 3 NH₄⁺+ 12 МоО₄^–2 + 24 Н⁺ (NH₄)₃РО₄ ^. 12 МоО₃ + 12 Н₂О

Ход работы.В четыре пронумерованные пробирки наливают по 1 мл 10 % раствора трихлоруксусной кислоты (ТХУ). В ступке растирают 1 г отмытых и отделенных на воронке Бюхнера дрожжей с 1 г глюкозы или сахарозы и 5 мл дистиллированной воды. К смеси добавляют 5 мл раствора фосфорнокислых солей, перемешивают и 1 мл смеси переносят в первую пробирку с ТХУ. При этом осаждаются белки, инактивируются ферменты и прекращается брожение.

Оставшуюся смесь переносят в высокий стаканчик и помещают в термостат при 37 С на 1,5 часа. Через каждые 0,5 часа от начала брожения отбирают из стаканчика по 1 мл бродящей смеси в три пробирки с ТХУ. Через 5 минут после взятия последней пробы содержимое пробирок фильтруют через складчатые фильтры в 4 пронумерованные колбочки и получают безбелковые фильтраты.

В четыре чистые пробирки отбирают по 0,5 мл безбелкового фильтрата из колбочек и проводят молибденовую реакцию на фосфорную кислоту. Для этого в каждую пробирку вносят по 0,1 мл 2,5 % – ного раствора молибденовокислого аммония в серной кислоте и 0,5 мл 0,5 %–ного раствора аскорбиновой кислоты, перемешивают и оставляют на 15 минут. Затем в каждую пробирку добавляют по 8 мл дистиллированной воды, перемешивают и сравнивают окраску жидкости во всех пробирках. Интенсивность окраски должна уменьшаться от первой к четвертой пробирке, так как неорганический фосфат в процессе брожения убывает.

Для гидролиза образовавшихся органических соединений фосфора в четыре пронумерованные пробирки (второй ряд) вносят из колбочек по 0,5 мл безбелкового фильтрата и добавляют по 0,5 мл 2 н. раствора соляной кислоты и ставят в кипящую водяную баню на 8–10 минут. По окончании гидролиза во всех пробирках проделывают молибденовую реакцию.

Результаты работы заносят в таблицу 1, изображая интенсивность окраски знаками +1; +2; +3; +4.

Таблица 1 – Интенсивность окраски молибденовой реакции

в процессе брожения

Материалы и реактивы: дрожжи; 10 %–ный раствор трихлоруксусной кислоты; глюкоза или сахароза; фосфорнокислые соли, раствор (см. Приложение В,п.1); молибденовый аммоний, 2,5 % раствор в 10 % растворе серной кислоты; 0,5 %–ный раствор аскорбиновой кислоты; 2 н. раствор соляной кислоты.

Оборудование: фарфоровые ступки; пробирки; пипетки на 1 мл; колбы; термостат; водяная баня.

1.2 Определение специфичности лактатдегидрогеназы

Лактатдегидрогеназа (ЛДГ) катализирует превращение пирувата в лактат на последней стадии гликолиза:

пируват лактат

Принцип метода.В ходе реакции кофермент НАДН + Н⁺окисляется до НАД+ и поглощение при 340 нм, характерное для НАДН + Н⁺, уменьшается. Учитывая коэффициент молярной экстинкции НАДН, равный при 340 нм 6,2210^–3, рассчитывают скорости ферментативной реакции в микромолях/мин. Для проверки специфичности ЛДГ можно вместо пирувата использовать другую кетокислоту –оксалоацетат или–кетоглутарат.

Ход работы.В кювету спектрофотометра помещают 1 мл раствора пирувата; 1,7 мл 0,1 М фосфатного буфера (рН 7,5); 0,2 мл раствора НАДН + Н⁺и 0,1 мл раствора ЛДГ (или 0,1 мл сыворотки) и измеряют поглощение при 340 нм с интервалом 1 мин в течение 10 минут.

Отдельно измеряют поглощение в пробе, содержащей вместо ЛДГ 0,1 мл 0,1 М фосфатного буфера, рН 7,5 (контрольная проба). Количество образовавшегося НАД⁺рассчитывают по разнице между величиной поглощения в контрольной пробе при 340 нм и величиной поглощения в каждый момент времени протекания реакции.

Рассчитывают скорость реакции в микромолях/мин и строят график зависимости скорости реакций от времени, находят начальную скорость ферментной реакции.

Аналогично проводят определение с раствором оксалоацетата и делают вывод о специфичности действия ЛДГ.

Материалы и реактивы: фосфатный буфер, рН 7,5 (см. Приложение В, п.2); раствор ЛДГ в 0,1 М фосфатном буфере, (рН 7,5), 5 мкг в 1мл, или сыворотка как источник ЛДГ; раствор НАДН в 0,1 М фосфатном буфере, 2 мг/мл; раствор пирувата или оксалоацетата 10^–3М в 0,1 М фосфатном буфере, рН 7,5.

2 Флавиновые дегидрогеназы

Кофакторами для них являются флавинадениндинуклеотид (ФАД) или флавинмононуклеотид (ФМН). Эти кофакторы являются производными рибофлавина (витамина В₂).