Файл: Ферменты.doc

ксантин мочевая кислота

Фермент способен окислять не только указанные пурины, но также птерины и ароматические и алифатические альдегиды. Так, например, формальдегид окисляется молекулярным кислородом при участии ксантиноксидазы с образованием муравьиной кислоты и перекиси водорода:

О О

// ксантиноксидаза //

НС + Н₂О + О₂ Н С + Н₂О₂

\ \

Н ОН

формальдегид муравьиная кислота

При определенных условиях ксантиноксидаза может передавать электроны и протоны не только кислороду воздуха, но и цитохромной системе. В условиях эксперимента ксантиноксидаза способна окислять субстрат за счет восстановления метиленовой сини и других красок, например, индиго, индофенола и др. Ксантиноксидаза содержится в молоке, печени, а так же в других тканях растительного и животного происхождения.

Оптимум действия ксантиноксидазы лежит в диапозоне рН от 5,5 до 8,5. Ксантиноксидаза является флавопротеидом, содержащим металл молибден (М₀). Флавопроиды имеют в качестве простетической группы вещества, окрашенные в желтый цвет и построенные по типу флавинмононуклеотида (ФМН) или флафинадениндинуклеотида (ФАД).

При восстановлении ФМН и ФАД превращаются в дигидроформу. В отличии от оксидаз геминовой природы (цитохром-оксидазы), катализирующих окисление субстрата молекулярным кислородом с образованием молекулы воды, при действии на субстрат оксидаз флавиновой природы конечным продуктом является перекись водорода.

Разрушение перекиси водорода осуществляется при участии геминовых ферментов каталазы и пероксидазы. Если перекись водорода не удаляется из сферы реакции, то действие флавиновых оксидаз прекращается.

Принцип метода.Если к свежему молоку, содержащему фермент ксантиноксидазу, добавить формальдегид и метиленовую синь, и смесь изолировать от доступа кислорода, то спустя некоторое время синее окрашивание исчезнет.

Реакция обусловлена восстановлением метиленовой сини в лейкоформу за счет окисления формальдегида в муравьиную кислоту и проходит благодаря каталитическому действию фермента ксантиноксидазы.

Ход работы.В три пробирки наливают по 5 мл свежего коровьего молока. Одну пробу кипятят 2-3 минуты и охлаждают. В прокипяченную пробирку и в одну из некипяченных проб добавляют по 1 мл 0,4 % раствора формальдегида, а в другую некипяченную 1мл воды. Затем во все три пробирки приливают по 1 мл 0,1 % раствора метиленового синего. Содержимое пробирок хорошо перемешивают и заливают 3-4 капли вазелинового масла для предохранения жидкости от соприкосновения с кислородом воздуха. Все пробы помещают в водяную баню, нагретую до 40⁰С. Через некоторое время жидкость в некипяченной пробе, содержащей субстрат, обесцвечивается за счет образования восстановленной формы метиленового синего.

Если бесцветный раствор метиленового синего встряхнуть, то раствор вновь приобретет синий цвет.

Вследствие отсутствия активного фермента в первой прокипяченной и субстрата в одной из некипяченных проб обесцвечивание метиленового синего в них не происходит.

Материала и реактивы: молоко свежее; 0,4 % раствор формальдегида; 0,02 н. раствор метиленовой синий; вазелиновое масло.

Оборудование: водяная баня; термостат; пробирки химические.

3 Гемсодержащие ферменты - гемопротеины

Гемопротеины в своем составе наряду с белками содержат гем. В основе строения гема лежит порфириновое кольцо, являющееся производным тетрапирольного соединения порфирина. Последний состоит из 4-х замещенных пирролов, соединенных между собой метиленовыми мостиками (СН=). Незамещенный порфирин называется порфином. В молекуле гема порфин представлен в виде протопорфирина IX, содержащего 4 метильные группы (СН₃), две винильные группы (СН=СН₂) и два остатка пропионовой кислоты. Протопорфирин, присоединяя железо, превращается в гем:

Гем в виде гемпорфирина является простетической группой ферментов каталазы, пероксидазы, цитохромоксидазы а ^ а₃. и др.

3.1 Каталаза (1.11.1.6)

Фермент, неизменно присутствующий в аэробных клетках. Она катализирует разложение перекиси водорода на кислород и воду:

каталаза

2 Н₂О₂> О₂+ 2 Н₂О

Каталаза содержит 0,009 % железа. Молекула фермента содержит 4 геминовых группы, из которых каждая прочно соединена с белком своими двумя карбоксильными группами. Катализ не сопровождается изменением валентности железа.

Каталаза выполняет защитные функции, препятствуя накоплению Н₂О₂, оказывающей повреждающее действие на клеточные компоненты.

В пищевой промышленности каталаза используется для удаления избытка Н₂О₂ при обработке молока в сыроделии, где Н₂О₂используется в качестве консерванта, а также совместно с глюкозооксидазой применяется для удаления кислорода и следов глюкозы.

3.1.1 Обнаружение действие каталазы (качественно)

Каталазное расщепление представляет собой особый случай пероксидазной реакции, когда пероксид водорода служит в качестве субстрата и акцептора. Каталаза переносит водород с одной молекулы пероксида на кислород другой молекулы пероксида, в результате чего пероксид разлагается на воду и кислород:

каталаза

Н₂О₂+ Н₂О₂ > О₂+ 2 Н₂О

В работе источником каталазы является кровь.

Ход работы.В пробирку вносят 1 мл крови или вытяжки из моркови и добавляют 1 мл 3 % Н₂О₂. Отмечают выделение кислорода в виде пены. Повторяют такой же опыт с прокипяченной кровью.

Результаты опыта оформляют в виде таблицы и делают выводы.

Таблица 3  Основные параметры опыта и его результаты

Материалы и реактивы:кровь дифибринированная или вытяжка из моркови (картофеля) (см. Приложение В, п. 7); 3 % -ная - Н₂О_2;

3.1.2 Определение активности каталазы по а. Н. Баху и а.И. Опарину

Принцип методаоснован на учете изменения количества пероксида водорода, расщепляющегося под действием этого фермента, который определяется путем титрования перманганатом калия. Реакция идет по уравнению:

2 КМnО₄+ 5 Н₂О₂+ Н₂SО₄4 КНSО₄+ 2 МnSО₄+ 8 Н₂О + 5О₂

О количестве перекиси водорода, разрушенной ферментом, судят по разности количеств мл 0,1 н. раствора КМnО₄, израсходованных для титрования в контрольном и рабочем опытах.

Ход работы.Отбирают две пробы прозрачного фильтрата или центрифугата по 20 мл каждая ( опытная и контрольная); последнюю кипятят 5 минут на сетке для инактивации фермента.

К пробам прибавляют по 20 мл дистиллированной воды, по 3 мл 1%–го пероксида водорода, предварительно нейтрализованного 0,1 н. раствором NаОН, и оставляют на 30 минут при комнатной температуре. Затем к пробам прибавляют по 5 мл 10% –ной серной кислоты и оставшийся пероксид водорода титруют 0,1 н. раствором марганцовокислого калия. Об активности каталазы судят по количеству миллиграммов перекиси водорода, которое разрушилось в течение 30 минут ферментом, содержащимся в 1 г исследуемого материала.