Файл: Ферменты.doc

Флавиновые кофакторы прочно связаны с апоферментом, следовательно, являются простетической группой.

В ходе реакции отщепляемые от субстрата атомы водорода присоединяются к изоаллоксазиновой группировке кофактора:

окисленная форма восстановленная форма

Флавиновые ферменты по типу катализируемой реакции делятся на две группы: первая группа - это ферменты, которые передают водород или электрон промежуточным соединениям, и вторая группа (оксидазы) - которые могут передавать отнятый водород кислороду воздуха.

К первой группе относятся флавопротеины: пируватдегидрогеназа, дегидрогеназа Д - аминокислот (1.4.99.1), сукцинатдегидрогеназа и др.

Ко второй группе - ксантиноксидаза (1.2.3.2.), пируватоксидаза (1.2.3.3.), глюкозооксидаза и др. ферменты.

2.1 Качественное определение активности сукцинатдегидрогеназы

Сукцинатдегидрогеназа (1.3.99.1.) катализирует окисление сукцината до фумарата. Кофактором фермента является ФАД - флавинадениндинуклеотид.

Реакция, катализируемая сукцинатдегидрогеназой, характеризуется абсолютной стереоспецифичностью элиминирования водорода, так что отщепляются исключительно атомы водорода в транс - положении. Если бы подобная специфичность не существовала, образовалась бы смесь (50:50) двух изомерных ненасыщенных дикарбоновых кислот; малеиновой (цис) и фумаровой (транс). Однако образуется только фумаровая кислота:

FАD FАDН₂

 Цис и транс изомеры получились бы совместно,

 если реакцияидет неспецифична 

Среди ферментов цикла лимоннонной кислоты сукцинатдегидрогеназа занимает особое место, поскольку локализована в митохондриальной мембране:

окисленная форма восстановленная форма

(синий цвет) (бесцветная)

Принцип метода.В условиях опыта в качестве акцептора водорода при окислении сукцината используется 2,6 - дихлорфенолиндофенол, его натриевая соль.

В водном растворе окисленная форма 2,6 - дихлорфенолиндофенола окрашена в синий цвет. Восстановленная форма этого соединения - бесцветна. Активность сукцинатдегидрогеназы мышц обнаруживают, добавляя к мышечной кашице растворы янтарной кислоты и натриевой соли окисленной формы 2,6 - дихлорфенолиндофенола. Если сукцинатдегидрогеназа активна, интенсивность синей окраски ослабевается, благодаря бесцветной форме 2,6 - дихлорфенолиндофенола.

Ход работы.В две пробирки отмеривают по 3 мл фосфатного буфера с рН 7,4. В одну пробирку(опытную) добавляют 5 капель 5 %- ного раствора янтарной кислоты и (для нейтрализации) 5 капель 0,1 н. раствора едкого натра, в другую (контрольную) приливают 10 капель дистиллированной воды. В обе пробирки добавляют по 1 мл 0,001 н. раствора 2,6 - дихлорфенолиндофенола и по 50 мг хорошо измельченной мышечной ткани (свежей). Обе пробирки помещают на 20 мин. в термостат при 37⁰С. Сравнивают интенсивность окрашивания в контрольной и опытной пробирках. Делают выводы и оформляют таблицу 2.

Таблица 2 - Основные параметры опыта и его результаты

Материалы и реактивы: экстракт мышечной ткани (см. Приложение В, п.3); фосфатный буфер, рН 7,4 (см. Приложение В, п.4); 5 % - ный раствор янтарной кислоты; 0,1 н. раствор NаОН; 0,001 н. раствор 2,6 - дихлорфенолиндофенола.

Оборудование:пробирки; пипетки; термостат.