Файл: Ферменты.doc

Это фермент известен под различными тривиальными названиями: о - дифенолоксидаза, тирозиназа, фенолаза, катехолаза и др. Фермент может катализировать окисление моно-, ди- и полифенолов.

Типичная реакция, катализируемая полифенолоксидазой, имеет вид:

Н 		Н 
С // \		С // \
Н С С  ОН   + 1/2 О₂	полифенолоксидаза >	Н С С = О   + Н₂О
Н С С  ОН \\ / С		Н С С = О \\ / С
 Н		 Н

пирокатехин о - бензохинон

Молекула фермента обладает четвертичной структурой. Полифенолоксидаза - купропротеид. Содержание меди - 0,2 %.

В зависимости от того, из какого источника выделен фермент, способность его к окислению различных фенолов различна. Более того, даже в одном и том же объекте полифенолоксидаза может содержаться в виде различных молекулярных форм, отличающихся по способности к окислению различных фенолов:

монофенол о-дифенол о-хинон



// \

Н С С  ОН

  

Н С С  ОН

  

Н С С = О + Н₂О

 

R  С СН

\\ /

R  С С ОН

\\ /

R С С = О

\\ /



Н 1/2О₂

 2Н



монофенолазное

действие

1/2О₂

катехолазное

действие

О₂ Н₂О

фенолоксидазное действие

При окислении монофенолов фермент действует бифункционально. Во - первых, происходит связывание атома кислорода с ароматическим кольцом с образованием о-дифенола (монофенолазное действие), далее, от о-дифенола отнимаются два атома водорода, которые переносятся на кислород с образованием воды (катехолазное действие, поскольку окисляются производные пирокатехина). Большинство препаратов фенолоксидаз способны окислять дифенолы без сопряжения с окислением монофенолов.

Темноокрашенные продукты (флобафены, меланины), возникающие как следствие действия фермента, образуются в результате чисто химической нонденсации двух образовавшихся хинонов.

С действием этого фермента связано образование темноокрашенных соединений меланинов при окислении кислородом воздуха аминокислоты - тирозина. Потемнение срезов картофеля, яблок, грибов и др. в значительной степени или полностью зависит от действия полифенолоксидазы.

В пищевой промышленности интерес к этому ферменту сосредоточен на предотвращении, рассмотренного нами ферментативного потемнения, которое имеет место при сушке плодов, овощей, при выработке соков, а также при производстве макаронных изделий из муки с повышенной активностью полифенолоксидазы. Эта цель достигается путем тепловой денатурации фермента (бланшировка), добавлением ингибиторов (NаНSО₃, SО₂, NаСI) или добавлением высоких концентраций аскорбиновой кислоты, которая вызывает восстановление хинонов, тем самым предотвращая их полимеризацию.

Положительная роль фермента отмечается при ферментации чая, табака. Окисление дубильных веществ чая под действием фермента приводит к образованию темноокрашенных ароматических соединений, определяющих цвет и аромат чая.

4.3 Обнаружение действия фенолоксидазы (качественно)

Фенолоксидаза катализирует окисление полифенолов с участием кислорода воздуха как акцептора водорода.

Источником фенолоксидазы служит картофель, гваяковая смола содержит субстрат полифенолпирокатехин. При действии фенолоксидазы на пирокатехин получается продукт окисления о - бензохинон, окрашенный в синий цвет. Реакция идет по следующей схеме:

Н 		Н 
С // \		С // \
Н С С  ОН   + 1/2 О₂	фенолоксидаза >	Н С С = О   + Н₂О
Н С С  ОН \\ / С		Н С С = О \\ / С
 Н		 Н
пирокатехин (бесцветный) о - бензохинон (синий)

Ход работы. На разрезы сырого и вареного картофеля наносят по 1-2 капли 1 % - ного спиртового раствора гваяковой смолы (0,02 М раствора пирокатехина) и отмечают появление окраски на одном из срезов картофеля. Отмечают разницу в окраске на срезах. Результаты опытов оформляют в виде таблицы 5 и делают выводы.

Таблица 5Основные параметры опыта и его результаты

№

опыта

Субстрат

Фермент

Тип кализиру- емой реакции

Условия проведения опыта (t^oС, рН, добавление др. реагентов)

Наблюде-ния

Материалы и реактивы: картофель сырой и варенный; 1 % - ный раствор гваяковой смолы в этаноле или 0,02 М раствор пироктехина.

Оборудование капельницы.

4.4 Определение активности о - дифенолоксидазы (полифенолоксидазы) и пероксидазы по Михлину и Броневицкой

Принцип метода определения активностио–дифенолоксидазы и пероксидазы основан на вторичном окислении аскорбиновой кислоты хинонами, образующимися из пирокатехина под действием ферментов. Избыток неокисленной кислоты оттитровывают йодом: