Файл: Ферменты.doc

2.2 Глюкозооксидаза (1.1.3.4)

Это двухкомпонентный фермент, содержащий в качестве простетической группы две молекулы флавинаденидинуклеотида (ФАД). Этот фермент катализирует дегидрирование глюкозы и перенос отнятого водорода на кислород воздуха с образованием пероксида водорода. При этом глюкоза превращается в глюконолактон:

СН2ОН				СН2ОН
Н  О ОН				Н  О
Н		+ О2		Н С = О
ОН Н				ОН Н +	Н2О2
НО Н				НО
Н ОН				Н ОН
 - D- глюкопираноза - глюконолактон

В живых клетках и неочищенных ферментных препаратах, используемых в промышленности, глюкозооксидаза всегда присутствует с глюконолактоназой и каталазой, глюконолактон превращается в глюконовую кислоту:

Пероксид водорода разлагается каталазой:

каталаза

2 Н₂О₂2 Н₂О + О₂

Так как очищенные препараты глюкозооксидазы взаимодействуют практически лишь с глюкозой, она является одним из важнейших ферментов, применяемых в пищевой технологии и клинической биохимии для определения сахара.

Глюкозооксидаза используется в пищевой промышленности как для удаления следов глюкозы, так и для удаления следов кислорода, при производстве сухого яичного порошка, пива, вина, соков, майонеза. Для удаления кислорода из продуктов, содержащих жир, упаковочный материал - синтетическую пленку - пропитывают глюкозооксидазой, глюкозой и буфером.

2.3 Определение глюкозы с использованием фермента

глюкозоксидазы

Принцип метода. Глюкозоокидаза катализирует окисление глюкозы кислородом воздуха с образованием глюконовой кислоты и пероксида водорода:

Глюкозоокидаза

С₆Н₁₂О₆+ Н₂О + О₂  С₆Н₁₂О₇+ Н₂О₂

Перекись водорода под действием другого фермента – пероксидазы – окисляет какой–либо хромогенный субстрат с образованием окрашенного соединения. Обычно используют о–дианизидин:

Продукт окисления в сильно кислой среде имеет интенсивную окраску. Метод позволяет избирательно определить содержание глюкозы в присут-ствии любых других сахаров.

Ход работы.Раствор 3 доводят до температуры 18–25С. В обычные пробирки помещают по 2 мл этого раствора, добавляя по 0,1 мл раствора глюкозы и оставляют при температуре 18–25С в темноте (во избежании фотоокисления) на 1,5 ч. Параллельно ставят 2 контрольных опыта (по 0,1 мл воды) и один стандарт (0,1 мл стандартного раствора глюкозы). По окончании реакции во все пробирки добавляют по 2 мл 16 н. раствора Н₂SО₄и тщательно перемешивают растворы. Интенсивность окраски стандартного раствора и обычных проб измеряют на ФЭКе против контроля при 530 нм. Содержание глюкозы определяют, сравнивая поглощение опытного D_опи стандартного D_страстворов:

,(1)

где С_х– содержание глюкозы, мкг/мл;

D_оп– экстинкция (оптическая плотность) опытной пробы;

Dст– экстинкция (оптическая плотность) стандартного раствора.

Диапазон чувствительности метода: 20 – 150 мкг/мл глюкозы.

Материалы и реактивы: раствор 1 - раствор ферментов (см. Приложение В, п.5); раствор 2 - о–дианизидина в воде, концентрация 4,75 мг/мл. Растворы 1 и 2 хранят в холодильнике до 6 месяцев, перед определением готовят раствор 3 (см. Приложение В, п.6); 16 н. раствор Н₂SО₄; стандартный раствор глюкозы 150 мг/мл.

Оборудование: пробирки; пипетки; черная бумага; аптечные резинки; фотоэлектроколориметр.

2.4 Открытие ксантиноксидазы в молоке

Ксантиноксидаза (1.2.3.2.) относится к группе окислительно-восстановительных ферментов. Акцептором электронов служит кислород.

Ксантиноксидаза катализирует окисление гипоксантина в ксантин, а так же ксантина в мочевую кислоту:

гипоксантин ксантин