Файл: Ферменты.doc

3 г. испытуемого материала растирают в ступке с 20 мл 0,3 М ацетатного буфера с рН 4,7, переносят в колбу и оставляют на 30 минут для настаивания при комнатной температуре. После настаивания вытяжку центрифугируют.

Определение активности о–дифенолоксидазы (Е₀). К 1 мл центрифугата (ферментная вытяжка) добавляют 3 мл дистиллированной воды, 2 мл 0,1 %–ного раствора аскорбиновой кислоты и 1 мл 0,02 М раствора пирокатехина. Смесь встряхивают 2 минуты, добавляют 1 мл 10 %–ного раствора фосфорной кислоты и титруют из микробюретки 0,01 н раствором йода в присутствии нескольких капель крахмала. Параллельно проводят контрольное определение с прокипяченной вытяжкой (1 мл вытяжки и 3 мл дистиллированной воды кипятят 1 минуту, затем добавляют 1 мл воды взамен испарившейся при кипячении, и все необходимые реактивы, как и в случае с опытной пробой).

Активность выражают в мл 0,01 н раствора йода на 1 г испытуемого материала по разности контрольной и опытной пробы.

Определение суммарной активности о–дифенолоксидазы и пероксидазы в присутствии перекиси водорода (Е_о+n).

К 1 мл центрифугата добавляют 3 мл дистиллированной воды,1 мл 0,4%–ного раствора перекиси водорода, 2 мл 0,1%–ного раствора аскорбиновой кислоты и 1 мл 0,02 М раствора пирокатехина. (Все растворы и вода должны иметь температуру 18–20 С). Смесь встряхивают 2 минуты, добавляют 1 мл 10%–ного раствора фосфорной кислоты и титруют из микробюретки 0,01 н раствором йода в присутствии крахмала.

Активность пероксидазы (Еn) определяют по разности суммарной активности о–дифенолоксидазы и пероксидазы и активности одной о–дифенолоксидазы:

Е_n= Е_o+n– Е_o

Результаты записывают в таблицу 6.

Таблица 6 - Основные параметры опыта и его результаты

Материал	Ферменты
	о-дифенолоксидаза и пероксидаза				о-дифенолоксидаза				пероксидаза
	Vo	Vk	Vk-Vo	Е_о+п (Vk-Vo)20  n	Vo	Vk	Vk-Vo	Е_о (Vk-Vo)20  n	Е_n= Е_o+n– Е_o

Где: Vo– объем, пошедший на титрование опытной пробы, мл 0,01 н I₂;

Vk – объем, пошедший на титрование контрольной пробы, мл 0,01 н I₂;

Vk-Vo – разность показаний титрования контрольной и опытной пробы, мл 0,01 н I₂;

Еo+n – активность о–дифенолоксидазы и пероксидазы мл 0,01 н. I₂/г;

Еo – активность о–дифенолоксидазы, мл 0,01 н. I₂/г;

Еn – активность пероксидазы, мл 0,01 н. I₂/ г;

n– навеска, г.

Материалы и реактивы:картофель, солод, мука, капуста, хрен, яблоки; 0,3 М раствор ацетатного буфера рН = 4,7 (см. Приложение В, п.12); 0,1 %–ный раствор аскорбиновой кислоты; 0,02 М раствор пирокатехина; 0,4 %–ный раствор пероксида водорода; 10 %–ный раствор ортофосфорной кислоты; 0,01 н. раствор йода; крахмал, индикаторный раствор (см. Приложение В, п.13).

Оборудование:ступки; пипетки на 20 мл; колбы на 50 мл; микробюретки; центрифуга.

5 Список используемых источников

Биохимия: Практикум.–К.:Выща шк.Изд–во при Киев. ун–те,1988. – 128с.
Бышевский А.Ш., Терсенов О.А. Биохимия для врача.–Екатеринбург: Издательско–полиграфическое предприятие "Уральский рабочий",1994.–384с.
Добрынина В.Н., Свешникова Е.Я.Руководство к практическим занятиям по биологической химии.– М.: Медицина,1967.–343с.
Кретович В.Л.Биохимия растений.–М.:Высш.шк.,1986.–503с.
Лебедева П.Т.,Усович А.Т. Методы исследования кормов, органов и тканей животных.– М.: Россельхозиздат,1965.–711 с.
Лабораторные методы исследования в клинике: Справочник.–М.: Медицина,1987.– 368 с.
Марри Р.,Греннер Д.,Мейес П., Родуэлл В. Биохимия человека; В 2–х т.–М.: Мир,1993.
Мелентьева Г.А.Фармацевтическая химия.т.II.–М.:Медицина,1976.–827 с.
Методы анализа пищевых, сельскохозяйственных продуктов и медицинских препаратов.– М.:Пищевая промышленность,1974.–743 с.
Петров К.П. Практикум по биохимии пищевого сырья растительного происхождения.– М.: Пищевая промышленность,1965.–300 с.
Плешков Б.П. Практикум по биохимии растений.–М.:Агропромиздат,1985.–255 с.
Практикум по биохимии сельскохозяйственных животных.– М: Высш. школа,1980.–303 с.
Пустовалова Л.М. Практикум по биохимии – Ростов на Дону:Изд–во"Феникс", 1999.–544 с.
Руководство к лабораторным занятиям по биологической химии. М.: Медицина,1976.–294 с.
Справочник биохимика.– М.: Мир,1991.–554 с.
Филлипович Ю.Б., Основы биохимии: Учеб. для хим. и биолог. спец. пед. ун–тов и ин–тов.– 4–е изд., перераб. и доп.– М.: изд–во "Агар", 1999.–512с.
Шапиро Д.К. Практикум по биологической химии.– Мн.: Вышэйш. школа,1976.–288 с

18.Березов Т.Т., Коровкин Б.Ф. Биологическая химия: Учебник.– 3-е изд., перераб. и доп. – М.: Медицина, 1998.– 704 с. ил

Приложение а

(справочное)

Значение стандартных окислительно- - восстановительных потенциалов

Таблица А1- Значение стандартных окислительно-восстановитель-ных потенциалов (в вольтах, концентрации компонентов 1 М, рН=7, t 25⁰С )

Восстановленная форма	Окислен-ная форма	Полуреакция	Е⁰, В
НАДН + Н⁺	НАД⁺	НАД⁺+2Н⁺+ 2е^-НАДН+Н⁺	-0,32
НАДФН+ Н⁺	НАДФ⁺	НАДФ⁺+2Н⁺+2е^-НАДФН+Н⁺	- 0,325
ФАДН ₂	ФАД⁺	ФАД⁺+2Н⁺+ 2е^-ФАДН₂	- 0,05
С₆Н₈О₆(аскорби- новая к-та	С₆Н₈О₆	С₆Н₈О₆+ 2Н⁺+ 2е^-С₆Н₈О₆	+0,17(1)
Сu^o	Сu⁺²	Сu⁺² + 2å^- Сu^o	+0,34(2)
Сu^o	Сu⁺¹	Сu⁺¹ + 1å^- Сu^o	+0,52(3)
Н₂О	Ѕ О₂	Ѕ О₂+2Н⁺+ 2е^-Н₂О	+0,82(4)

Приложение в

(справочное)

Методика приготовления реактивов

Фосфорнокислые соли, раствор. 6 г Na₂НРО₄2Н₂О смешивают с 2 г КН₂РО₄Н₂О в 1 л воды.
Фосфатный буфер, рН 7,5. Готовят растворы А и Б. Приготовление раствора А: 1/15 М КН₂РО₄(9,078 г/л). Приготовление раствора Б: Nа₂НРО₄2 Н₂О (11,876 г/л). Для приготовления фосфатного буфера рН 7,5 смешивают 130 мл раствора А и 870 мл раствора Б.
Экстракт мышечной ткани. 300 мг мышечной ткани экстрагируют в фарфоровой ступке с 20 - кратным объемом дистиллированной воды. Смеси фильтруют через марлю и экстракцию повторяют еще 2 раза. Отмытая от редуцирующих веществ мышечная кашица содержит сукцинатдегидрогеназу, и некоторые другие ферменты ( цитохром, цитохромоксидазу прочно связанные с клеточной структурой.
Фосфатный буфер, рН 7,4. Готовят растворы А и Б. Приготовление раствора А: 1/15 М КН₂РО₄(9,078 г/л). Приготовление раствора Б: Nа₂НРО₄2 Н₂О (11,876 г/л). Для приготовления фосфатного буфера рН 7,4 смешивают 192 мл раствора А и 808 мл раствора Б.
Раствор фермента. 250 мкг глюкозооксидазы из плесневого гриба и 41,7 мкг пероксидазы из корней хрена растворяют в 10 мл 0,1 М Nа-фосфатного буфера, рН 7,0.
Раствор 3. Один объем раствора 2 осторожно прибавляют по капле при интенсивном перемешивании к 100 объемам раствора 1.
Кровь дифибринированная или вытяжка из моркови (картофеля). Морковь натирают на терке, берут 4 г, растирают с битым стеклом в ступке, добавляя 4-6 мл 0,05 % - ного раствора углекислого натрия. Растертую массу переносят в мерную колбу на 100 мл и доводят до метки раствором Nа₂СО₃. Смесь настаивают 30 - 60 мин. и фильтруют.
Вытяжка из муки или другого растительного материала. На аналитических весах отвешивают по разности в мерную колбу (вместимостью 50 мл) 2 г муки или хорошо измельченного растительного продукта. В колбу приливают дистиллированную воду, содержимое ее хорошо перемешивают, добавляют 2-3 капли толуола, доводят водой до метки и смесь настаивают 2 ч при комнатной температуре. Затем жидкость отфильтровывают через сухой складчатый фильтр или центрифугируют. В фильтрате или центрифугате тот час же определяют каталазу.
Экстракт из хрена или вытяжка из мяса; 100 г свежих корней хрена натирают на терке, заливают 100 мл 0,05 % - ного раствора Nа₂СО₃и через 2 -3 часа фильтруют. Вытяжка из мяса. 10 г фарша свежего мяса заливают 40 мл дистиллированной воды, настаивают 10 мин. и фильтруют.
Ферментный раствор. 100 г свежих корней хрена натирают на терке, заливают 100 мл 0,05 % - ного раствора Nа₂СО₃и через 2 -3 часа фильтруют. Фильтрат является источником пероксидазы.
Фосфатный буфер с рН 7,3 - 7,4. Готовят растворы А и Б. Приготовление раствора А: 1/15 М КН₂РО₄(9,078 г/л). Приготовление раствора Б: Nа₂НРО₄2 Н₂О (11,876 г/л). Для приготовления фосфатного буфера рН 7,3 - 7,4 смешивают 192 мл раствора А и 808 мл раствора Б.
Ацетатный буфер, 0,3 М раствор, рН 4,7. Состоит из двух растворов в соотношении 1:1: 0,3 М раствор уксусной кислоты и 0,3 М раствор уксуснокислого натрия.
Крахмал, индикаторный раствор. 1 г. растворимого крахмала размешивают с 10 мл холодной воды и постепенно вливают в 90 мл кипящего насыщенного раствора хлорида натрия, нагревают до кипения и охлаждают.