Файл: Ферменты.doc

Активность каталазы Е_копределяют по формуле:

(Vk - Vo) ^.1,7

Е_k=,(2)

n

где Ек – активность каталазы;

Vk – количество 0,1 н. раствора КМnО4, израсходованного для титрования контроля, мл;

Vo – количество 0,1 н. раствора КМnО4, израсходованного на титрование рабочего опыта, мл (1 мл 0,1 н. раствора КМnО₄ эквивалентен 1,7 мг Н₂О₂);

n – навеска исследуемого материала в титруемой пробе, г.

Материалы и реактивы:1%–ный раствор пероксида водорода; 0,1 н. раствор марганцовокислого калия; 10 %–ный раствор серной кислоты; вытяжка из муки или другого растительного материала (см. Приложение В, п.8).

3.2 Пероксидаза (1.11.1.7)

Пероксидаза - это двухкомпонентный фермент состоящий из гема и гликопротеида. Она катализирует реакцию:

RООН + АН₂ > Н₂О + RОН + А,

где в качестве RООН могут быть Н₂О₂или органические пероксиды, т.е. она высокоспецифична в отношении акцептора водорода и совсем не специфична в отношении донора водорода (ими могут служить фенолы, амины и другие органические соединения, т.е. обладает широкой субстратной специфичностью).

Механизм действия пероксидазы можно представить следующим образом:

Пер(ОН) + Н₂О₂ Пер (ООН) + Н₂О

Пер(ООН) + АН₂ Пер (ОН) + Н₂О +А

Пероксидаза с пероксидом водорода образует промежуточное комплексное соединение, в результате чего пероксид активируется и действует как акцептор водорода.

Действие пероксидазы может быть желательным при ферментации чая и табака, т. к. наряду с полифенолоксидазой она способствует образованию окрашенных и ароматизированных компонентов. В некоторых случаях действие пероксидазы нежелательно так, для увеличения лежкости и сохранности перерабатываемых продуктов необходимо удалить или ингибировать пероксидазу вместе с полифенолоксидазой. Наиболее активна пероксидаза из корней хрена.

3.2.1 Обнаружение действия пероксидазы (качественно)

Источником пероксидазы служит водный экстракт из хрена, капусты, репы, брюквы, мышечной ткани, а источником окисляемого соединения - гваяковая смола, содержащая полифенол - пирокатехин.

Реакция идет по следующей схеме:

пирокатехин о - бензохинон

(бесцветный) (синий)

Ход работы. В одну пробирку вносят 2 мл экстракта из хрена или мяса; во вторую пробирку - 2 мл прокипяченного экстракта из хрена. В каждую пробирку добавляют по 2 капли 1 % - ного раствора гваяковой смолы ( или 0,02 М пирокатехина) и отмечают окрашивание получившихся растворов. В каждую пробирку добавляют по 1- 2 капли 3 % - ной Н₂О₂. Отмечают изменение окраски в пробирках.

Результаты опыта оформляют в виде таблицы 4 и делают выводы.

Таблица 4Основные параметры опыта и его результаты

Материалы и реактивы: экстракт из хрена или вытяжка из мяса (см. Приложение В, п. 9); 1 % - ный раствор гваяковой смолы в этаноле или 0,02 М раствор пирокатехина; 3 % - ный раствор Н₂О_2.

Оборудовани:. пробирки; пипетки.

3.2.2 Определение активности пероксидазы

Принцип методаметод основан на определении скорости реакции окисления бензидина под действием пероксидазы с образованием продуктов окисления определенной концентрации, заранее установленной на фотоэлектроколориметре.

Ход работы.В две кюветы шириной 2 см фотоэлектроколориметре наливают по 2 мл ферментного раствора, 2 мл раствора бензидина в ацетатном буфере, содержимое перемешивают. Измерения проводят при длине волны 600–650 нм. Вначале устанавливают стрелку гальванометра в крайнее правое положение (например, 0,125 или 0,250). После этого в контрольную (левую) кювету наливают 2 мл воды, а в правую (опытную) – 2 мл 3%–ного раствора перокида водорода. С внесением первой капли перекиси водорода включают секундомер. При этом под действием пероксидазы происходит реакция окисления бензидина с образованием соединения синего цвета, и стрелки гальванометра начинают отклоняться к нулевому положению. Секундомер останавливают, когда стрелка гальванометра достигает нулевого деления. Активность фермента А вычитают по скорости реакции и выражают в условных единицах на 1 г растительного материала по следующей формуле:

D ^.(V - b)

Е_n=,(3)

n ^.c^.t

где Е_n– активность фермента на 1 г навески;

D – экстинкциях (0,125 или 0,250);

V – объем вытяжки, мл;

b – степень разведения вытяжки в кювете (3);

n – навеска растительного материала, г;

с – толщина слоя жидкости в кювете (2 см);

t – время, с.

Материалы и реактивы:ферментный раствор (см. Приложение В, п.10); 3%–ный раствор перекиси водорода; раствор 0,005 М бензидина на фосфатном буфере с рН 7,0.

Оборудовани: пипетки на 2 мл; кюветы; ФЭК; секундомер.

4 Медь - содержащие оксидазы

Эти ферменты обеспечивают непосредственное окисление субстратов с передачей атомов водорода на кислород. Концентрированные растворы этих ферментов имеют синий цвет, их называют “синими оксидазами”. Характерным представителем этой группы оксидаз является аскорбатоксидаза и полифенолоксидаза.

4.1 Определение активности аскорбатоксидазы

Аскорбатоксидаза (1.10.3.3) в качестве функциональной группы содержит медь. Фермент, который катализирует окисление аскорбиновой кислоты в дегидроаскорбиновую, согласно реакции:

О= С 					О= С 
					
НОС			аскорбат-		О = С
О	+ 1/2 О2		>		 О	+	Н2О
НОС			оксидаза		О = С
					
НС					НС 
					
НОСН					НОСН
					
СН2ОН					СН2ОН
L - аскорбиновая дегидро - L - аскорбиновая кислота кислота

Медь в ходе ферментативной реакции меняет свою валентность.

Аскорбатоксидаза содержится во многих высших растениях. Она ответственна за разрушение витамина С при технологической переработке этих растительных материалов. Нежелательное действие фермента можно предотвратить, подвергнув его кратковременному нагреванию (денатурации) - бланшировке. В тоже время аскорбатоксидаза положительно влияет на окраску и аромат растительных продуктов, например, соков, связывая кислород.

Принцип метода заключается на свойстве аскорбиновой кислоты поглощать максимум света при длине волны 265 нм. Об активности фермента судят по уменьшению величины оптической плотности, учитывая, что степень окисления аскорбиновой кислоты пропорциональна количеству фермента.

Ход работы. Навеску листьев 1 г0,001 г тщательно растирают в фарфоровой ступке и переносят в мерную колбу на 50 мл с помощью охлажденного фосфатного буфера. Экстракт центрифугируют при 4000 об/мин или фильтруют на холоде в течении короткого времени. В опытную кювету вносят 0,1 мл раствора МgSO₄; 2 мл фосфатного буфера; 0,1 мл ферментной вытяжки (центрифугата или фильтрата) и 0,7 мл аскорбиновой кислоты. Устанавливают нулевое положение на приборе по кювете, в которой вносят те же компоненты, что и в опыте, только вместо аскорбиновой кислоты приливают 0,7 мл воды. С началом измерения опытного образца включают секундомер. Первое измерение проводят через 30 с, а затем повторно каждую минуту в течении 5 - 6 минут или другой интервал времени, в зависимости от активности фермента.

При длительной экспозиции делают контроль на самоокисление аскорбиновой кислоты. Для этого в кювету спектрофотометра вносят 2,3 мл фосфатного буфера и 0,7 мл аскорбиновой кислоты, определяют оптическую плотность контрольного раствора в те же промежутки времени, что и основного раствора.

Активность фермента Е, выраженную в единицах оптической плотности, вычисляют по формуле:

(D₁ - D₂)ас

Е = ,(4)

(t₁- t₂)bn

где Е - активность фермента;

D₁ - оптическая плотность раствора в начале определения;

D₂ - оптическая плотность раствора через определенный промежуток времени;

а - общий объем экстракта, мл;

b - объем фильтрата в кювете, мл;

с - общий объем жидкости в кювете, мл;

t - время, мин;

n - масса навески, г.

Материалы и реактивы: фосфатный буфер с рН 7,3- 7,4 (см. Приложение В, п. 11); 0,005 М раствор КСI; 0,005 М раствор МgSO₄; 0,00005 М раствор аскорбиновой кислоты.