Файл: prakt_lf_mdd_fiu.pdf

21 

РАБОТА № 2. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ПРОТЕОЛИТИЧЕСКОЙ 

АКТИВНОСТИ ТРИПСИНА 

 
ОБОСНОВАНИЕ  ВЫПОЛНЕНИЯ  РАБОТЫ.  Протеолитический 

фермент  трипсин  осуществляет  расщепление  пищевых  белков  в  со-
держимом  двенадцатиперстной  кишки  в  верхних  отделах  тонкого 
кишечника.  Фермент  используется  также  для  расщепления  белков  в 
лабораторных условиях. 

 
ПРИНЦИП  МЕТОДА.  Протеолитическая  активность  трипсина 

регистрируется по количеству освобождающегося аргинина и лизина, 
которые  с  фенольным  реактивом  дают  синюю  окраску,  измеряемую 
колориметрически. 

ХОД  РАБОТЫ:  взять  две  центрифужные  пробирки:    контроль-

ную и опытную. 

ОТМЕРИТЬ 

КОНТРОЛЬ 

О П Ы Т 

Раствор белка 
Фосфатный буфер  

       рН-8,0 

ТХУ,  10 % 
Раствор трипсина 

0,5 мл 

1,0 мл 

2,0мл 

0,5 мл 

0,5 мл 

1,0 мл 

- 

0,5 мл 

Инкубация 20 минут, при  37

о

 С в термостате 

ТХУ, 10 % 

2 мл 

Центрифугирование 10 минут, 1500 об/мин. 
Центрифугат перелить в сухие пробирки. 
раствор NaOH 0,5 М 
фенольный реактив  

5,0 мл 
0,5 мл 

5,0 мл 
0,5 мл 

Размешать. Инкубация 20 минут при  18

о

 С 

 
РЕЗУЛЬТАТ: 
 
 
 
В Ы В О Д:  
 

22 

Дата: _______________

ЗАНЯТИЕ № 5

РАБОТА № 1. ВЛИЯНИЕ ТЕМПЕРАТУРЫ НА АКТИВНОСТЬ 

АМИЛАЗЫ 

ОБОСНОВАНИЕ  ВЫПОЛНЕНИЯ  РАБОТЫ.  Позволяет  охарак-

теризовать  одно  из  свойств  ферментов  –  зависимость  протекания 
ферментативных реакций от температуры (термолабильность). 

 
ПРИНЦИП МЕТОДА: 
                 амилаза                           амилаза 
Крахмал ---------    декстрины  ------------   мальтоза. 
 
Крахмал дает с иодом синий цвет. 
Декстрины дают с иодом фиолетовое, красно-бурое окрашивание. 
Мальтоза – желтый (цвет иода в воде). 
 
ХОД РАБОТЫ:  взять три пробирки, опыт 1-3. Развести слюну 1 : 

10 (1мл слюны  в отдельной пробирке +  9мл Н

2

О). 

ОТМЕРИТЬ  

ОПЫТ-1 

ОПЫТ-2 

ОПЫТ-3 

Крахмал 1 % 
Амилаза слюны 
(разведение 1:10) 

0,5 мл 
0,5 мл 

0,5 мл 
0,5 мл 

0,5 мл 
0,5 мл 

Поместить пробирки 
на 10 минут 

Комнатная  
температура 
(20

о

С) 

Термостат 
(40

о

С) 

Кипящая во-
дяная баня 
(100

о

С) 

Через 10 минут во все пробирки добавить по 1-2 капли  

KJ 1% 

23 

РЕЗУЛЬТАТ:  

 
ВЫВОД:  
 

РАБОТА № 2. ВЛИЯНИЕ АКТИВАТОРОВ И 

ИНГИБИТОРОВ НА АКТИВНОСТЬ АМИЛАЗЫ СЛЮНЫ 

ОБОСНОВАНИЕ  ВЫПОЛНЕНИЯ  РАБОТЫ.  Активаторы  и  ин-

гибиторы регулируют действие ферментов. Эти сведения используют 
для  изучения  влияния  ксенобиотиков  и  изучения  воздействия  на  эн-
зимы изменяющихся концентраций нормальных метаболитов клетки. 

ПРИНЦИП МЕТОДА. При активации идет конформационная пе-

рестройка  активного  центра  фермента  и  увеличивается  скорость  ре-
акции. Ингибиторы оказывают противоположное действие (механиз-
мы различны: через аллостерический центр, путем ковалентного свя-
зывания, денатурации и т.д.). 

ХОД РАБОТЫ: взять три пробирки: контрольную и две опытные. 

ОТМЕРИТЬ  

КОНТРОЛЬ 

ОПЫТ 1  

ОПЫТ  2 

Н

2

0 

NaCl  1 % 
CuSO

4

  1 % 

Амилаза слюны (1: 10) 
Крахмал 1% 

10 капель 
- 
- 
20 капель 
5 капель 

8 капель 
2 капли 
- 
20 капель 
5 капель 

8 капель 
- 
2 капли  
20 капель 
5 капель 
 

24 

Пробирки оставить при комнатной температуре на 5 минут  
(10, 15 минут). 

Добавить по 2-3 капли раствора йода во все пробирки. 
 
РЕЗУЛЬТАТ:  
 
 
 
 
ВЫВОД:  
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 

РАБОТА № 3. ОПРЕДЕЛЕНИЕ АКТИВНОСТИ АМИЛАЗЫ 

(ДИАСТАЗЫ) В СЫВОРОТКЕ КРОВИ И МОЧЕ 

ПО МЕТОДУ КАРАВЕЯ  

ОБОСНОВАНИЕ  ВЫПОЛНЕНИЯ  РАБОТЫ.  Определение  ак-

тивности амилазы в моче и сыворотке крови используют для диагно-
стики заболеваний поджелудочной железы. 

 
ПРИНЦИП МЕТОДА. Метод основан на колориметрическом оп-

ределении концентрации крахмального субстрата до и после его фер-
ментативного гидролиза.  В качестве рабочего раствора используется 
0,01 н. раствор йода. 

25 

ХОД РАБОТЫ:  
Длина волны 

630-690 нм 

(красный светофильтр), кювета с тол-

щиной слоя 1 см. 

В 2-х пробирках (опытной и контрольной) проводят анализ со-

гласно таблице: 

КОМПОНЕНТЫ 

ОПЫТНАЯ  

ПРОБА 

КОНТРОЛЬНАЯ 

РАБОТА 

Раствор стойкого 

крахмального суб-

страта 

0,5 мл 

0,5 мл 

прогреть 5 мин в водяном термостате при 37

°

 С 

Негемолизированная 

сыворотка крови 

10 мкл 

- 

прогреть 5 мин в водяном термостате при 37

º

 С 

Рабочий раствор 

йода (0,01 н.) 

0,5 мл 

0,5 мл 

Дистиллированная 

вода 

4 мл 

4 мл 

Негемолизированная 

сыворотка крови 

- 

10 млк 

пробирки встряхивают 
и растворы фотометрируют относительно воды 

РАСЧЕТЫ.    Расчет  активности  α-амилазы  в  г  расщепленного 

крахмала на 1 л сыворотки за 1 час инкубации при 37

0

 С производят 

по формуле:           

                                            Е

к

 – Е

оп 

                          Х   =   --------------------  х 240 
                                                Е

к 

Е

к

  - экстинкция контрольной пробы; 

Е

оп

 – экстинкция опытной пробы. 

РЕЗУЛЬТАТ: