Файл: yablonskii_v_a_praktichne_akusherstvo_ginekologiya_ta_bioteh.pdf

125 

За

морфологічними

ознаками

розрізняють

ембріони

: 

нормальні

; 

з

незначними

відхиленнями

; 

із

збільшеною

кількістю

дегенерова

-

них

клітин

 (

табл

. 11). 

11. 

Шкала

оцінки

якості

ембріонів

за

М

.

І

.

Сергєєвим

Стадії

розвитку

Морфологічні

ознаки

Оцінка

Балів

Умов

. 

позн

. 

Морула

Кругла

форма

, 

ціла

прозора

оболонка

, 

прозорий

перивітеліновий

простір

, 

блас

-

томери

чіткі

, 

однакового

розміру

, 

прото

-

плазма

зерниста

. 

Відмінно

 5 ++ 

У

перивітеліновому

просторі

гранули

та

включення

, 

бластомери

неоднакового

роз

-

міру

, 

розміщені

асиметрично

, 

дещо

здав

-

лені

Добре

 4 

+ 

Гранули

та

включення

в

перивітеліновому

просторі

, 

зародок

частковий

, 

незначне

здавлювання

бластомерів

, 

окремі

з

них

пошкоджені

Задовільно

 3  + 

−

Деформація

прозорої

оболонки

, 

частковий

розпад

бластомерів

, 

порушений

зв

’

язок

між

ними

, 

фрагментація

цитоплазми

, 

здавлення

бластомерів

Умовно

придатні

2 

+ 

−

−

Невідповідність

між

стадією

розвитку

і

віком

ембріонів

, 

дефекти

прозорої

оболон

-

ки

  (

тріщини

, 

сколи

), 

розпад

бластомерів

, 

сильне

їх

здавлення

Непридатні

 1 

−

−

−

Бласто

-

циста

Кругла

форма

, 

прозора

оболонка

однако

-

вої

товщини

, 

перивітеліновий

простір

ву

-

зький

, 

прозорий

, 

чітке

диференціювання

клітин

трофобласту

та

ембріобласту

, 

чітко

виділяється

бластоцель

Відмінно

 5 

+ 

+ 

Прозора

оболонка

стоншена

, 

порожнина

бластоцисти

велика

, 

займає

весь

периві

-

теліновий

простір

, 

має

гладеньку

повер

-

хню

, 

чітку

диференціацію

клітин

, 

бласто

-

цель

не

виражений

, 

у

перивітнліновому

просторі

гранули

, 

включення

, 

клітини

трофобласту

дещо

здавлені

Добре

 4 

+ 

Перивітеліновий

простір

збільшений

, 

є

включення

, 

гранули

, 

бластоцель

не

вира

-

жений

, 

немає

диференціації

між

клітина

-

ми

трофобласту

та

ембріобласту

Задовільно

 3  + 

−

Дефект

прозорої

оболонки

  (

тріщини

, 

ско

-

ли

), 

наявність

гранул

, 

клітинних

фрагме

-

нтів

у

перивітеліновому

просторі

, 

часткове

руйнування

клітин

, 

здавлення

бластоцеля

Умовно

придатні

2 

+ 

−

−

Значний

дефект

прозорої

оболонки

, 

роз

-

пад

бластомерів

, 

рихле

їх

з

’

єднання

Умовно

непридатні

1 

−

−

−

126 

3.8. 

Методи

зберігання

ембріонів

Мета

заняття

: 

Оволодіти

методами

культивування

, 

короткочасного

і

тривалого

зберігання

вимитих

ембріонів

. 

Місце

проведення

заняття

: 

лабораторія

кафедри

, 

центр

трансплантації

ембріонів

. 

Оснащення

заняття

: 

взяті

ембріони

, 

середовище

Дюльбекко

, 

фетальна

сироватка

, 

96 %-

й

спирт

, 

диметилсульфоксид

, 

гліцерин

, 

сахароза

, 

годинникові

скельця

, 

малі

і

великі

чашки

Петрі

, 

пайєти

, 

градуйовані

скляні

циліндри

на

 500 

мл

, 

ділильна

лій

-

ка

, 

сифонні

шланги

, 

пастерівські

піпетки

, 

пробірки

, 

ампули

, 

термостат

, 

інвертова

-

ний

мікроскоп

, 

апарат

для

кріоконсервування

ембріонів

, 

бінокулярна

лупа

, 

паперові

фільтри

, 

бактерицидні

лампи

, 

халати

, 

ковпаки

. 

Короткочасне

зберігання

ембріонів

.

Від

вимивання

ембріонів

до

пересадки

їх

реципієнтам

проходить

звичайно

не

менше

 3 

год

. 

Протягом

цього

часу

потрібно

зберегти

життєздатність

ембріонів

. 

Для

цього

їх

можна

помістити

в

 0,5 

мл

середовища

для

культиву

-

вання

ембріонів

на

годинниковому

скельці

, 

поставити

його

в

сте

-

рильну

чашку

Петрі

, 

дно

якої

вистелене

вологим

фільтрувальним

папером

, 

накрити

і

поставити

в

термостат

з

температурою

 37 °

С

.  

Для

тривалого

зберігання

ембріона

його

засмоктують

в

пайєту

так

, 

щоб

з

обох

боків

його

утворилися

повітряні

пухирці

довжиною

1 – 1,5 

см

. 

Закривають

кінці

пайєти

сталевими

кульками

або

полі

-

етиленовими

корками

і

вміщують

у

термостат

при

 37 °

С

. 

Можна

збе

-

рігати

ембріони

і

під

шаром

стерильного

вазелінового

масла

на

го

-

динниковому

склі

чи

в

пробірці

. 

За

таких

умов

біологічно

повноцін

-

ні

ембріони

можуть

культивуватися

протягом

 24 – 48 

год

, 

хоча

цим

методом

користуються

лише

як

вимушеним

заходом

. 

В

кінці

куль

-

тивування

обов

’

язково

перевіряють

під

мікроскопом

життєздатність

ембріонів

. 

Зберігають

ембріони

також

при

знижених

плюсових

тем

-

пературах

, 

що

викликають

зворотне

гальмування

метаболічних

процесів

. 

Кріоконсервування

ембріонів

.

Оптимальною

стадією

для

замо

-

рожування

ембріонів

великої

рогатої

худоби

є

рання

бластоциста

, 

овець

і

кіз

 — 

пізня

морула

або

рання

бластоциста

, 

свиней

 — 

блас

-

тоциста

. 

Краще

витримують

заморожування

свіжі

ембріони

. 

Заморожування

ембріонів

набагато

складніше

, 

ніж

заморожу

-

вання

сперми

, 

тому

що

вони

є

багатоклітинними

утвореннями

. 

Для

того

, 

щоб

запобігти

кристалізації

внутрішньоклі

-

тинної

води

, 

до

складу

середо

-

вища

додають

кріопротектори

диметилсульфоксид

  (

ДМСО

) 

чи

гліцерин

, 

а

щоб

уникнути

осмотичних

зрушень

, 

штучно

стимулюють

кристалізацію

на

певній

стадії

. 

Рис

. 65. 

Схема

заповнення

пайєти

середо

-

вищем

і

розміщення

в

ньому

ембріона

:  

1 – 3

 — 

середовище

по

краях

соломинки

; 

2

 — 

пробка

-

фільтр

для

виштовхування

ембріона

; 

4

 — 

повітряні

проміжки

; 

5

 — 

середовище

з

ембріоном

127 

На

перших

етапах

розробки

технології

насичення

  (

еквілібрації

) 

кріопротектором

середовища

з

ембріоном

проводили

, 

поступово

пе

-

реносячи

ембріони

на

годинникових

скельцях

у

чашці

Петрі

з

роз

-

чину

з

меншою

концентрацією

кріопротектора

у

розчин

з

вищою

його

концентрацією

 (0,25; 0,5; 1,0; 1,5 

М

ДМСО

), 

витримуючи

у

кож

-

ній

з

них

по

 5 

хв

 (

чи

 3,3; 6,6 

та

 10 %-

му

гліцерині

). 

Закінчивши

 «

на

-

сичення

» 

ембріонів

кріопротектором

, 

їх

розфасовували

в

пайєтах

у

такій

послідовності

: 

середовище

  —  

повітря

  —  

середовище

з

ембріо

-

ном

  —  

повітря

   —  

середовище

  (

рис

. 65). 

Кожен

стовпчик

має

дов

-

жину

  1 – 2 

см

. 

Один

край

пайєти

закривали

зволоженим

корком

, 

після

чого

заморожували

. 

Для

зниження

перепаду

температур

і

уникнення

осмотичних

змін

за

 3 – 4 

с

до

початку

утворення

льоду

 (

мінус

 6 – 7 º

С

) 

стимулю

-

вали

кристалізацію

, 

додаючи

до

розчину

зернину

льоду

, 

кристалик

срібла

йодиду

чи

просто

торкаючись

переохолодженим

предметом

(

проколюють

фольгу

пінцетом

з

намерзлою

на

кінці

краплею

сере

-

довища

і

швидко

торкаються

нею

поверхні

рідини

). 

Після

розморожування

ембріонів

їх

відмивали

від

кріопротекто

-

ра

, 

переносячи

поступово

з

розчинів

з

більшою

концентрацією

кріо

-

протектора

в

менш

концентровані

розчини

з

часом

витримування

в

кожному

розчині

ДМСО

 5 

хв

, 

а

в

гліцерині

 — 10 

хв

. 

Нині

застосовують

простіший

 (

одноступінчастий

) 

метод

насичен

-

ня

кріопротектором

. 

Після

морфологічної

оцінки

та

відмивання

ем

-

бріонів

від

механічних

забруднень

їх

вміщують

у

 1,4 

М

розчин

глі

-

церину

і

витримують

 15 – 20 

хв

. 

Для

приготування

розчину

до

 9 

мл

одного

із

середовищ

для

тканинних

культур

або

Дюльбекко

з

 0,4 %-

м

бичачим

сироватковим

альбуміном

додають

 1 

мл

гліцерину

. 

Для

запобігання

контамінації

ембріонів

патогенними

та

умовно

пато

-

генними

мікроорганізмами

середовище

проціджують

крізь

фільтр

типу

 «

Мілекс

», «Millipore» 

з

діаметром

пор

 0,22 

мк

. 

Після

витримування

ембріонів

у

 1,4 

М

розчині

гліцерину

їх

пе

-

реносять

у

соломинки

  (

пайєти

) 

в

такій

послідовності

, 

як

зазначено

вище

. 

Розморожують

ембріони

, 

заморожені

в

пробірках

, 

у

водяній

бані

при

температурі

 30 – 35 

º

С

. 

Заморожені

в

пайєтах

ембріони

вийма

-

ють

з

посудини

Дьюара

, 

витримують

 6 – 8 

с

на

повітрі

при

кімнат

-

ній

температурі

, 

вміщують

у

водяну

баню

при

температурі

 25

– 

30 

º

С

на

 10 –  15 

с

до

зникнення

льоду

. 

Після

цього

видаляють

із

пайєти

маркерний

корок

, 

зрізають

ножицями

ватний

корок

і

вміст

соломин

-

ки

зливають

на

годинникове

скельце

. 

Останнім

часом

запропоновано

технології

заморожування

ембрі

-

онів

у

соломинках

, 

які

містять

одночасно

два

середовища

 — 

для

за

-

морожування

 (1,5 

М

розчин

гліцерину

та

ФБС

з

додаванням

 10 %-

ої

128 

сироватки

крові

і

вміщеним

у

ній

ембріоном

) 

та

середовище

для

роз

-

морожування

 (1,08 

М

розчин

сахарози

на

ФБС

). 

Сахароза

прискорює

видалення

кріопротектора

при

розморожу

-

ванні

ембріонів

. 

Не

проникаючи

в

клітини

, 

вона

підтримує

постійну

зовнішню

осмомолярність

і

пом

’

якшує

осмотичний

шок

. 

Розчин

са

-

харози

засмоктують

у

пайєту

з

просоченим

кріопротектором

ембріо

-

ном

з

таким

розрахунком

, 

щоб

між

цими

двома

розчинами

був

пу

-

хирець

повітря

. 

Простерилізований

фільтрацією

 1,5 

М

розчин

гліцерину

на

фос

-

фатно

-

буферному

середовищі

з

додаванням

 10 %-

ої

сироватки

крові

набирають

у

пайєту

на

 5 

мм

довжини

стовпчика

, 

за

ним

має

бути

такої

ж

довжини

пухирець

повітря

, 

далі

засмоктують

на

таку

саму

довжину

середовище

з

ембріоном

і

знову

пухирець

повітря

. 

Нареш

-

ті

, 

набирають

на

таку

саму

довжину

 1,08 

М

розчин

сахарози

у

фос

-

фатно

-

буферному

середовищі

. 

Закривають

один

край

пайєти

зволо

-

женим

корком

і

заморожують

. 

Після

розморожування

соломинку

струшують

  (

для

змішування

середовищ

), 

витримують

 10 – 20 

хв

при

кімнатній

температурі

і

пе

-

ресаджують

ембріон

реципієнтові

. 

В

Інституті

тваринництва

УААН

при

заморожуванні

ембріонів

за

сповільненим

режимом

насичення

ембріонів

кріопротектором

про

-

водять

одноступенево

, 

використовуючи

для

цього

 1,2 

М

розчин

глі

-

церину

, 

в

 20 %-

й

фетальній

сироватці

 (

ФС

) 

на

ФБС

. 

Насичені

гліцерином

зародки

розфасовують

у

пайєти

, 

а

саме

: 

спочатку

набирають

 0,75 

М

розчин

сахарози

на

 20 %-

му

розчині

фе

-

тальної

сироватки

в

ФБС

, 

потім

пухирець

повітря

довжиною

 2 – 3 

мм

, 

далі

ембріон

в

 1 

М

розчині

гліцерину

в

 20 %-

му

розчині

ФС

на

ФСБ

, 

знову

пухирець

повітря

 3 – 5 

мм

і

, 

нарешті

, 

знову

 0,75 

М

розчин

са

-

харози

в

 20 %-

му

розчині

ФС

в

ФБС

. 

Установка

для

заморожування

ембріонів

складається

з

посудини

Дьюара

, 

в

яку

за

допомогою

відповідного

пристосування

й

термопа

-

ри

з

заданою

програмою

охолодження

опускають

контейнер

із

запов

-

неними

ембріонами

пайєтами

. 

Для

розморожування

пайєт

їх

переносять

з

каністри

посудини

Дьюара

у

водяну

баню

кімнатної

температури

 (20 – 22 °

С

).  

При

надшвидкому

методі

заморожування

ембріони

мікропіпет

-

кою

переносять

у

краплю

 (150 – 300 

мкл

) 

еквілібрувального

розчину

(10 %-

го

розчину

гліцерину

на

 20 %-

й

ФС

в

ФБС

) 

у

чашці

Петрі

і

витримують

 10 

хв

, 

а

потім

 — 

в

іншу

чашку

Петрі

з

розчином

для

заморожування

 (

суміш

 30 %-

го

гліцерину

і

 70 %-

го

 1 

М

сахарози

на

20 %-

му

розчині

ФС

в

ФБС

), 

заправляють

у

соломинку

об

’

ємом

0,25 

мл

і

занурюють

у

рідкий

азот

. 

129 

Розморожування

ембріонів

проводять

на

водяній

бані

при

 40 °

С

протягом

 5 

с

і

видувають

середовище

з

ембріоном

у

краплю

 1 

М

роз

-

чину

сахарози

на

 20 %-

й

ФС

в

ФБС

. 

Через

 7 

хв

переносять

ембріони

в

поживне

середовище

, 

заправляють

у

соломинку

, 

як

вказувалося

вище

, 

і

використовують

для

трансплантації

. 

3.9. 

Пересадка

ембріонів

Мета

заняття

: 

оволодіти

методами

хірургічної

і

нехірургічної

пересадки

ембріонів

. 

Місце

проведення

заняття

: 

кафедра

, 

навчальний

пункт

трансплантації

ембріо

-

нів

, 

м

’

ясокомбінат

. 

Оснащення

заняття

: 

телиці

-

реципієнти

або

модельні

тварини

, 

статеві

органи

за

-

битих

на

м

’

ясокомбінаті

тварин

, 

заправлені

у

пайєти

ембріони

, 2 %-

й

розчин

новока

-

їну

, 

ксилокаїну

, 

медокаїну

, 

прокаїну

та

діоциду

, 

ромпун

, 

комбелен

, 96 %-

й

спирт

, 

вата

, 

гнучкий

прилад

Касу

та

катетер

для

пересадки

ембріонів

, 

захисні

чохли

, 

гіне

-

кологічні

рукавичці

, 

розширювачі

  (

дилятатори

шийки

матки

), 

інвертований

мікро

-

скоп

, 

бінокулярна

лупа

, 

пересувний

столик

для

інструментів

, 

халати

, 

фартухи

, 

гумо

-

ві

чоботи

. 

Короткі

методичні

вказівки

. 

Спочатку

викладач

демонструє

студентам

окремі

прийоми

введення

катетера

через

закриту

шийку

матки

на

органах

забитих

тварин

, 

потім

 — 

на

модельних

тваринах

. 

Розділившись

на

підгрупи

по

 2 – 3 

особи

, 

студенти

почергово

оволодівають

методом

введення

катетера

через

шийку

матки

в

ріг

матки

і

пересадки

ембріонів

.  

Нині

пересадку

ембріонів

здійснюють

переважно

нехірургічним

методом

 (

рис

. 66). 

Потрібні

для

цього

інструменти

 — 

металевий

ка

-

тетер

і

довга

капілярна

трубка

, 

в

передній

частині

якої

є

приставка

для

поміщення

ембріона

в

невеликій

кількості

середовища

.  

Якщо

пересадку

здійснюють

за

допомо

-

гою

гнучкого

приладу

Касу

, 

то

ембріон

треба

помістити

в

пайєту

  (

со

-

ломинку

), 

як

зазначено

вище

, 

вставити

її

в

на

-

конечник

приладу

і

з

’

єднати

його

з

основ

-

ною

трубкою

. 

Тварину

-

реципієнта

фіксують

у

станку

і

проводять

ректо

-

гені

-

тальне

обстеження

на

наявність

жовтого

тіла

в

яєчнику

. 

Тварини

, 

у

яких

не

виявлено

жовтого

тіла

, 

до

пересадки

не

допускаються

.  

Звільняють

пряму

кишку

тварини

від

калових

мас

, 

обмивають

теплою

водою

з

милом

і

обробляють

 70 %-

м

спиртом

, 

септонексом

чи

2 %-

м

розчином

діоциду

перинеальну

ділянку

, 

роблять

сакральну

анестезію

 2 %-

м

розчином

новокаїну

  (4 – 7 

мл

), 

сильнозбудливим

тваринам

вводять

міорелаксант

ромпун

чи

комбелен

 (0,5 

мл

). 

Рис

. 66. 

Схема

нехірургічної

пересадки

ембріонів