Файл: МИКРОБЫ ВСЕ ОТВЕТЫ.doc

41.Сучасні погляди на природу і походження вірусів. Місце вірусів у системі живого. Методи культивування вірусів та їх оцінка.

Походження вірусів

Віруси — збірна група, яка не має спільного предка. В даний час існує кілька гіпотез, що пояснюють походження вірусів.

Вважається, що великі ДНК-віруси походять від більш складних і, можливо, клітинних, таких як сучасні мікоплазми і рикетсії, внутрішньоклітинних паразитів, які втратили значну частину свого геному. І дійсно, деякі великі ДНК-віруси мімівіруса, вірус віспи кодують функціонально надлишкові на перший погляд ферменти, очевидно, що залишилися їм у спадок від складніших форм існування. Слід також зазначити, що деякі вірусні білки не виявляють ніякої гомології з білками бактерій, архей і еукаріот, що свідчить про порівняно давнє відокремлення цієї групи.

.Походження деяких РНК-вірусів повязують з віроідами.

Положення вірусів у системі живого

Віруси мають генетичні звязки з представниками флори і фауни Землі. Згідно з останніми дослідженнями, геном людини більш ніж на 32% складається з інформації, кодованої вірус-подібними елементами і транспозони. За допомогою вірусів може відбуватися так званий горизонтальний перенос генів ксенологія, тобто передача генетичної інформації не від батька до сина і так далі, а між двома неспорідненими

особинами. Так в геномі вищих приматів існує білок сінцітін, який, як вважається, був привнесений ретровірусом. Іноді віруси утворюють з тваринами симбіоз.

Методи культивування вірусів.

Культури клітин. Приготування первинної культури клітин складається з декількох послідовних етапів: подрібнення тканини, розєднання клітин шляхом тріпсінізаціі, відмивання отриманої однорідної суспензії ізольованих клітин від трипсину з наступним суспензуванням клітин у живильному середовищі, що забезпечує їх зростання, наприклад в середовищі 199 з додаванням телячої сироватки крові.

Перещеплювані культури на відміну від первинних адаптовані до умов, що забезпечує їм постійне існування, і зберігаються протягом декількох десятків пасажів.

Перещеплювані одношарові культури клітин готують із злоякісних і нормальних ліній клітин, що володіють здатністю тривалий розмножуватися в певних умовах. До них відносяться злоякісні клітини HeLa, спочатку виділені з карциноми шийки матки, Нер-3 з лімфоїдної карциноми, а також нормальні клітини амніону людини, нирок мавпи.

До напівперещеплюваних культур відносяться диплоїдні клітини людини. Вони являють собою клітинну систему, що зберігає в процес 50 пасажів до року диплоїдний набір хромосом, типовий для соматичних клітин використовуваної тканини. Диплоїдні клітини людини не зазнають злоякісного переродження і цим вигідно відрізняються від пухлинних.

Про розмноження репродукції вірусів в культурі клітин судять по цитопатичній дії ЦПД, яке може бути виявлена мікроскопічно і характеризується морфологічними змінами клітин.

Характер ЦПД вірусів використовують як для їх виявлення індикації, так і для орієнтовної ідентифікації, тобто визначення їх видової приналежності.

Один з методів індикації вірусів заснований на здатності поверхні клітин, в яких вони репродукуються, адсорбувати еритроцити — реакція гемадсорбції. Для її постановки в культуру клітин, заражених вірусами, додають суспензію еритроцитів і після деякого часу контакту клітини промивають ізотонічним розчином хлориду натрію. На поверхні уражених вірусами клітин залишаються прилип еритроцити.

Інший метод — реакція гемаглютинації РГ. Застосовується для виявлення вірусів у культуральній рідини культури клітин або хоріоналлантоісній або амніотичній рідині курячого ембріона.

Кількість вірусних частинок визначають методом титрування за ЦПД в культурі клітин. Для цього клітини культури заражають десятикратним розведенням вірусу. Після 6-7-денної інкубації їх дивляться на наявність ЦПД. За титр вірусу приймають найбільше розведення, яке викликає ЦПД в 50% заражених культур. Титр вірусу висловлюють кількістю цитопатичних доз.

Більш точним кількісним методом обліку окремих вірусних частинок є метод бляшок.

Деякі віруси можна виявити та ідентифікувати за включеннями, які вони утворюють в ядрі чи цитоплазмі заражених клітин.

Курячі ембріони. Курячі ембріони в порівнянні з культурами клітин значно рідше бувають контаміновані вірусами та мікоплазмами, а також володіють порівняно високою життєздатністю і стійкістю до різних впливів.

Для отримання чистих культур рикетсій, хламідій і ряду вірусів у діагностичних цілях, а також для приготування різноманітних препаратів вакцини, діагностикуми використовують 8-12-денні курячі ембріони. Про розмноження згаданих мікроорганізмів судять по морфологічних змінах, що виявляються після розтину ембріона на його оболонках.

Про репродукції деяких вірусів, наприклад грипу, віспи, можна судити з реакції гемаглютинації РГА з курячими або іншими еритроцитами.

До недоліків даного методу відносяться неможливість виявлення досліджуваного мікроорганізму без попереднього розтину ембріона, а також наявність в ньому великої кількості білків та інших сполук, що ускладнюють подальшу очистку рикетсій або вірусів при виготовленні різних препаратів.

Лабораторні тварини. Видова чутливість тварин до певного вірусу і їх вік визначають репродуктивну здатність вірусів. У багатьох випадках тільки новонароджені тварини чутливі до того чи іншого вірусу наприклад, миші-сосунки — до вірусів Коксакі.

Перевага даного методу перед іншими полягає в можливості виділення тих вірусів, які погано репродукуються в культурі або ембріоні. До його недоліків відносяться контамінація організму піддослідних тварин сторонніми вірусами та мікоплазмами, а також необхідність подальшого зараження культури клітин для отримання чистої лінії даного вірусу, що подовжує терміни дослідження.

42. Принципи класифікації вірусів. Основні властивості вірусів людини і тварин

В основу класифікації вірусів покладено такі властивості : тип нуклеїнової к-ти, вміст її у вібріоні у %, кількість ниток у ній, відносну молекулярну масу, а також особливості будови вірусів, їх репродукції.

Відомо 17 родин ДНК-геномних і 42 родини РНК-геномних, із них тільки 6 родин ДНК-геномних і 11 родин РНК-геномних вірусів мають значення в медицині та ветеринарії.

43.Методи культивування вірусів та їх оцінкадив. Запитання 41. Методи визначення репродукції вірусів.

Методи визначення репродукції вірусів: цитопатична діяЦПД, бляшкоутворення, формування включень, реакції гемаглютинації і гемадсорбції, кольорова проба.

ЦПД:

-повна дегенерація зморщування, пікноз клітин моно шару,що утворений на склі, злущування клітин із скла

-часткова дегенерація:

1.Симпластоутворення-злиття клітин між собою.

2.Гроноутворення-округлення клітин з частковим їх злиттям.

3.Вогнищевий тип деструкції моно шару,з наявністю ділянок ушкоджених і злущених клітин.

-проліфераціяонко клітини-нарощування клітин моношару

Включення.Утворення вірусами внутрішньоядерних та цитоплазматичних включень, динаміка їх формування, форма, розміри, кількість мають важливе діагностичне значення.

Бляшкоутворення.Здатність вірусів у присутності поживного покриття різного складу до локального розмноження у клітинній культурі з наступним руйнуванням сусідніх клітин і формування у моно шарі дефектів-вірусних бляшок.

Гемаглютинація і гемадсорбція див. запитання 41

Кольорова проба.Відображає метаболічні зміни клітин у процесі репродукції в них вірусів, що впливає на показники рН середовища. При репродукції вірусів метаболізм у клітині порушується і середовище зберігає свій колір.Якщо вірусу немає-середовище окислюється і індикатор змінює свій колір.

44. Реакції вірусної гемаглютинації і гемадсорбції. Механізм, практичне використання.

Реакція гемаглютинації заснована на здатності деяких вірусів викликати аглютинацію склеювання еритроцитів за рахунок вірусних глікопротеїнових шипів — гемаглютинінів.

Реакція гемадсорбції — здатність культур клітин, інфікованих гемаглютинуючими вірусами, адсорбувати на своїй поверхні еритроцити

45. Серолог.Р-ції, які викор.У вірусології. Р-ція нейтралізації, її механізм, практичне використання. Реакція вірус нейтралізації, механізми, практичне значення

Р-ції:р-ція гальм.гемаглютинаціїРГГА р-ція галмув.гемадсорбції РГГ; р-ція нейтралізації, кольорова проба, звязування комплементу, р-ції імунодифузії, зустрічного імуноелектрофорезу, імун.електр.мікроскопіїІЕМ, р-ція зворотної непряиої гемаглютинації. Р-ція нейтралізації: принцип її у взаємодії специф.антитіл імунної сироватки з вірусом, яке призв.до нейтралізації віруса. Р-цію можна ставити в культурах кл.з обліком результатів за цитопат.дією, вкольоровій пробі, за допомогою рН-метрії та феноменом бляшкоутворення.

46.Р-ція гальмування гемаглютинації,її механізм, практичне використання.

Р-ція базується на здатності блоквати гемаглютинуючі властивості вірусів, за доп.специф.антитіл.У результ цього затримка аглютинації еритроцитів. Компоненти р-ції: невідомі антигени, специф.імунні противірусні, сироватки, еритроцити.Еритроцити отрим.з крові птахів, ссавців, людини. Їх тричі промивають і зберіг у вигляді 0,5-1% суспензії. Імунні сироватки попередньо позбавляють неспециф. Інгібіторів, прогріваючи при темпер. 56С 30хв. Р-цію ставлять у пробірках. Позитивна р-ція коли утв. Червоний зернистий, з нерівними краями осад, який дифузно розташ.на дні пробірки. Негативна — наявн.компактного осаду у вигляді гудзика на дні пробірки. Р-цію викор для ідентифікації вірусів грипу, паротиту, енцефалітів….

47. Р-ція звязування комплементу. Принцип у взаємодії комплементу із специф.комплексом антиген-антитіло. Внаслідок цього не відбув.гемоліз сенсибілізованих еритроцитів. Компоненти: вірусовмісткий матеріал, специф.імунна сиворотка, гемоліт сиворотка, еритроцити барана та електроліт. До особл. РЗК при вірусолог інфекціях належить те, що її можна ставити як при темпер.37С, так і на холоду, а також викор.мікрометод, коли всі інгредієнти р-ції беруться в обємі не 0,5мл, а 0,25мл. РЗК викор.майже при всіх вірусних інфекціях.

48. Р-ції з міченими антитілами і антигенами у вірусології. Р-ція РІФ.До таких рцій відносять імуноферментний аналізІФА -виявл.антигену за доп.відповідних йому атитіл , конюгованих з ферментом — міткою. Радіоімунолог.аналізРІА-мічення радіонуклідом. Імуноблотинг — сполучення

електрофорезу і ІФА чи РІА.Реакція iмунофлюорiсценції- РIФ метод Кунса — заснована на тому, що антиген, оброблений iмунними сироватками з антитiлами, мiченими флюорохромами, здатний світитися в ультрафiолет.променях люмiнесцентного мiкроскопу прямий метод. Р-цiя Кунса може бути викор. як для виявл. антигенiв, так i для визнач.антитіл. Рiзновид — непрямий метод Кунса РНIФ. Застос. одна універсальна флюоресцируюча сироватка — антиглобулінова. На утвореному комплексі специфічні антитіла -досліджуваний антиген фіксуються флюоресцируючі антиглобулінові антитіла, які визивають світіння при люмінісцентний мікроскопії.

49. Викор.кліт.культур у вірусології.Класифікація культур кл. Поживні середовища для культив.кл. Підтримуючі та ростові середовища. У вірусології культури кл. викор. дуже широко, оск. з ними легко працювати у лабораторії, на відміну від інших методів — вирощ.вірусів на курячих ембріонах або у організмі живих тварин. Крім того на моношарі кліт. культури можна добре вивчити цитопат. дію вірусів, за утворенням внутрішньо-кліт. включень, бляшок, у р-ціях кольоровою пробою. При роботі з культурами кл. суттєві результати невеликою кількістю культур. Класиф: первинно-трипсинізовані, перещеплювані, диплоїдні культури кл. Ростові сер. Сприяють швидкому кліт.росту. Після формування моношару та перед інокуляцією віруса ростове сер.видаляють і замінюють підтримуючим-з низьким вмістом сироватки дозволяють зберегти культури кл. в стані повільного стійкого метаболізму в період розмнож. Вуруса.