Файл: Методички з Бх на 3 модуль.doc

Практичні роботи

Завдання 1. Виявлення глюкози в слині методом Фелінга (якісна реакція).

Принцип методу. Реакція грунтується на здатності альдегідної груни глюкози, при нагріванні в лужному середовищі окиснюватись, відновлюючи при цьому блакитний гідроксид міді (II) Cu(ОН)₂ в жовтий гідроксид міді (І) Cu(ОН). При подальшому нагріванні утворюється оксид міді (І) Cu ₂О цеглянисто-червоного кольору.

Реактив Фелінга, який використовують в реакції, отримують при змішуванні рівних кількостей розчину сульфату міді (розчин Фелінга 1) та лужного розчину сегнетової солі (розчин Фелінга 2). В результаті взаємодії сульфату міді з лугом утворюється гідроксид міді (II), який тут же вступає в реакцію з сегнетовою сіллю з утворенням темно-синього розчину мідно-винного комплексу (реактиву Фелінга).

Весь гідроксид міді (II) в реактиві Фелінга комплексно зв’язаний з сегнетовою сіллю, що перешкоджає утворенню з нього чорного осаду оксиду міді (II) при нагріванні.

Хід роботи. В пробірку вносять 1 мл слини, додають 10 крапель розчину Фелінга і нагрівають до кипіння. За наявності глюкози в слині випадає жовтий осад Cu(ОН) або цеглянисто-червоний Cu₂О. Інтенсивність забарвлення та кількість осаду залежать від вмісту глюкози в досліджуваній пробі слини.

Завдання 2. Виявити патологічні компоненти у шлунковому соку.

1. Виявлення молочної кислоти в шлунковому соку (якісна реакція) за методом Уффельмана.

Принцип методу. Метод ґрунтується на взаємодії комплексної сполуки феноляту заліза фіолетового кольору з молочною кислотою з утворенням лактату заліза жотувато-зеленого кольору.

Хід роботи 1. Приготування феноляту заліза: в колбу, що містить Юмл 1 % розчину фенолу, по краплях додають 1 % розчин хлориду заліза (III) до появи інтенсивного фіолетового забарвлення.

2. Виявлення молочної кислоти. У три пробірки, вносять по 2 MJ приготованого розчину феноляту заліза і додають: в першу пробірку - 1 мл 0,5 °/ розчину молочної кислоти; в другу пробірку - 1 мл шлункового соку; в треті пробірку - 1 мл води. Вміст пробірок добре перемішують і спостерігають з зміною забарвлення.

3. Експрес метод. В пробірку вносять 1 мл реактиву Уффельмана (комплексна сполука феноляту заліза) і додають 10 крапель слини. Розвивається жовто-зелене забарвлення (лактат заліза).

Клініко-діагностичне значення. Молочна кислота у вмісті цілую здорової людини не виявляється, але при ахлоргідрії, коли має місце бродіння, можна визначити звичайними якісними пробами. Наявність молочної кислоти збільшення органічних кислот у вмісті шлунка свідчить про бродіння вуглеводів у ньому.

2. Виявлення наявності крові у шлунковому соку бензидиново пробою.

Принцип методу. Кров виявляється за допомогою бензидинової проби, яка ґрунтується на здатності гемоглобіну каталізувати окислення бензидину пероксидом водню з утворенням продуктів окислення синього або зеленої кольору.

Хід роботи.

До 1 мл досліджуваного (патологічного) шлункового соку додають 5 крапель 10%-го розчину бензидину в оцтовій кислоті та 3 краплі 3%-го розчину пероксиду водню. За присутності крові розвивається синє або зелене забарвлені внаслідок окислення бензидину.

За результатами проведених експериментів зробити висновки.

Завдання 3. Дослідження активності ліпази підшлункової залози.

Принцип методу: Про активність панкреатичної ліпази судять кількості звільнених під дією ферментів жирних кислот, які відтитровують лугом.

Хід роботи: Три пробірки заповнюють за схемою, вміст пробірок інкубують на водяній бані при 37°С протягом 15 хв. Після інкубації проводять титрування ОД М розчином гідроксиду натрію в присутності фенолфталеїну Кількість лугу в мл, що пішла на титрування (нейтралізацію) звільнених жирних кислот, є показником активності ліпази.

Завдання 4. Кількісне визначення активності амілази слини методом Вольгемута.

Принцип методу. Метод Вольгемута грунтується на здатності амілази розщеплювати (гідролізувати) крохмаль. В ході роботи виявляють мінімальну кількість фермента, здатного повністю розщеплювати 1 мл 0,1%-го розчину крохмалю. Цю кількість фермента приймають за одиницю амілазної активності.

Амілазна активність виражається в кількості 0,1 %-го розчину крохмалю в мілілітрах, яку може розщепити (гідролізувати) 1 мл слини при температурі 37°С протягом 30 хв. В нормі амілазна активність слини А = 160 - 320.

Хід роботи: У сім пронумерованих пробірок вносять з бюретки по 1 мл води. У 1-у пробірку додають 1 мл розведеної у 10 разів слини. Вміст добре перемішують і 1 мл отриманого розчину переносять з першої пробірки до другої, з неї - до третьої і т.д. Таким чином у кожній наступній пробірці вміст ферменту буде у два рази меншим, ніж у попередній. Потім в усі пробірки наливають по 2 мл 0,1% розчину крохмалю, перемішують та ставлять пробірки на водяну баню (чи у термостат) при 37°С на 30 хв. Після цього пробірки виймають та охолоджують для завершення дії ферменту. В кожну пробірку додають по 2 краплі розчину йоду, добре перемішують та спостерігають за змінами кольору. Рідина у пробірках може забарвлюватися у жовтий, червоний та синій колір. Жовтий колір свідчить про повне розщеплення крохмалю. Результати спостережень вносять в таблицю, позначають синє, червоне та жовте забарвлення буквами "С", "Ч", "Ж". Відмічають останню пробірку з розчином жовтого кольору та розраховують активність амілази слини:

Розрахунок. Для обчислення активності амілази необхідно знати розведення слини в останній пробірці, де відбувся повний гідроліз крохмалю.

Наприклад, остання пробірка з розчином жовтого кольору виявляється четвертою) в якій слина розведена у 160 разів. Складають пропорцію та обчисляють активність амілази:

X=

1/160 мл слини розщеплює 2мл 0,1 %-го розчину крохмалю;

1 мл слини розщеплює х мл 0,1 %-го розчину крохмалю,

звідки

Х=

Клініко-діагностичне значення. Метод Вольгемута широко використовується в клінічній практиці для визначення амілазної активності крові та сечі. Зростання активності амілази (внаслідок збільшення кількості) в сироватці крові буде мати діагностичне значення для підтвердження наявності запалення підшлункової залози - панкреатиту. Внаслідок розвитку панкреатиту, при пошкодженні панкреацитів підвищується секреція панкреатичного соку, передчасне виділення та активація ферментів безпосередньо в протоках і клітинах залози. Внаслідок цього в кров попадають ферменти підшлункової залози, такі як трипсин і амілаза, активність якої в сироватці крові значно зростає.

Тема заняття № 9. Дослідження функціональної ролі водорозчинних (коферментних) та жиророзчинних вітамінів у метаболізмі та реалізації клітинних функцій

Теоретичні питання

1. Загальна характеристика вітамінів як компонентів харчування людини.

2. Водорозчинні коферментні вітаміни (В1, В2, РР, B6, В12, Н, фолієва кислота, пантотенова кислота, вітаміни, С, Р);

• структура біологічно активних форм;

• біохімічні функції та роль в обміні речовин;

• прояви недостатності та гіпервітамінозу;

3. Джерела та добова потреба. Жиророзчинні вітаміни(А, Е, К, F, D):

• біологічні властивості та роль в обміні речовин;

• прояви недостатності та гіпервітамінозу;

• джерела та добова потреба.

4. Біоантиоксидантні властивості коферментних та жиророзчинних вітамінів.

5. Хвороби вітамінної недостатності:

• екзогенні гіпо- та авітамінози;

• ендогенні гіпо-та авітамінози;

• клініко-біохімічні аспекти авітамінозів.

6. Використання вітамінних препаратів у профілактиці та лікуванні захворювань.

7. Вітамінні харчові добавки, профілактичні та лікувальні аспекти застосування.

Практичні роботи

Завдання 1. Виявлення та визначення вмісту водорозчинних вітамінів.

Робота 1. Визначення вітаміну С (аскорбінової кислоти) в сечі.

Для оцінки С-вітамінної забезпеченості організму найбільше поширення отримали прямі методи визначення аскорбінової кислоти в крові і сечі. Концентрація вітаміну в плазмі крові і виведення його з сечею знаходяться в тісному зв'язку і є показником забезпеченості харчового раціону вітаміном С.

Принцип методу. Аскорбінова кислота в кислому середовищі відновлює молекулярний йод. Поява синього забарвлення вказує на те, що вся аскорбінова кислота з відновленої форми перейшла в окислену, і перша надлишкова крапля розчину йоду в присутності крохмалю дає синє забарвлення.

Хід роботи. В колбу відміряють 5 мл сечі і додають 5 крапель розчину крохмалю. Титрують розчином йоду до появи синього забарвлення, що не зникає протягом 30 сек. Враховуючи, що 1 мл розчину йоду відповідає 1 мкмоль аскорбінової кислоти, обчислюють виділення аскорбінової кислоти за добу за формулою: