Файл: Методички з Бх на 3 модуль.doc

X = а ×1 × 1500 ÷ 5

де а - кількість мл розчину йоду, що пішла на титрування; 1500 - добовий діурез; 5 - об'єм сечі в пробі; X - вміст аскорбінової кислоти в добовій кількості сечі.

В нормі за добу з сечею виділяється 284-568 мкмоль аскорбінової кислоти.

Робота 2. Визначення вмісту аскорбінової кислоти в плазмі крові.

Принцип методу. Кількісне визначення вітаміну С грунтується на його здатності легко вступати у окисно-відновні реакції і відновлювати такі сполуки, як 2,6-дихлорфеноліндофенол (ДХФІФ). Розчин 2,6-ДХФІФ в нейтральному середовищі має синє забарвлення. Поки в розчині є аскорбінова кислота, 2,6-ДХФІФ відновлюється і при цьому знебарвлюється. Після окислення ним всієї аскорбінової кислоти надлишок реактиву забарвлює розчин в кислому середовищі в слабо рожевий колір.

Хід роботи. 1 мл робочого розчину (який містить одну частину плазми крові, одну частину бідистиляту та дві частини 5% розчину метафосфорної кислоти) титрують розчином 2,6-ДХФІФ з мікробюретки до появи рожевого забарвлення. Після чого титрування припиняють і відмічають кількість розчину 2,6-ДХФІФ, що пішла на титрування. Розрахунок проводять за формулою:

Х = а × 0,0045 ×1000 ÷ 1

де: а - кількість мл розчину 2,6-ДХФІФ, що пішла на титрування; 1000 - розрахунок на 1 л; 0,045 - кількість мкмоль аскорбінової кислоти, що відповідає титру розчину 2,6-ДХФІФ; X - вміст аскорбінової кислоти в плазмі крові; 1 - кількість мл плазми, взятої для аналізу.

В нормі в плазмі крові міститься 34,1-90,9 мкмоль/л аскорбінової кислоти.

Клініко-діагностичне і практичне значення. Вітамін С (аскорбінова кислота) є необхідним харчовим фактором в організмі людини. Аскорбінова кислота бере участь в окислювально-відновних реакціях, синтезі стероїдних гормонів у корі наднирників і катехоламінів у мозковому шарі наднирників, у процесах гідроксилювання й посттрансляційної модифікації колагену, в утворенні тетрагідрофолату з фолієвої кислоти; прискорює всмоктування заліза, активує пепсиноген. При нестачі вітаміну С організм втрачає здатність депонувати міжклітинні "цементуючі" речовини, що викликає ураження судинних стінок і опорних тканин.

Завдання 2. Виявлення жиророзчинних вітамінів.

Робота 1. Виявлення вітаміну А. Реакція Друммонда.

Принцип методу. Сірчана кислота (H₂SO₄), яка має водовіднімаючі (дегідратаційні) властивості, сприяє перетворенню вітаміну А - ретинолу в забарвлений комплекс фіолетово-червоного кольору.

Хід роботи. На сухе предметне скло наносять 2 краплі риб'ячого жиру в хлороформі і 1 краплю концентрованої сірчаної кислоти (H₂SO₄). Спостерігають за появою забарвлення.

Клініко-діагностичне й практичне значення. Вітамін А впливає на бар'єрну функцію шкіри, слизових оболонок, на проникність клітинних мембран і біосинтез їхніх компонентів, зокрема глікопротеїнів; бере участь в окислювально-відновних реакціях, оскільки здатний утворювати перекиси, які у свою чергу підвищують швидкість окислювання інших сполук.

При недостатності вітаміну А в людини з'являються симптоми гальмування росту, виснаження організму, специфічні ураження шкіри, слизових оболонок й очей. У першу чергу пошкоджується епітелій шкіри, що супроводжується його патологічним ороговінням. Наслідком цього порушення є, юява вторинних гнійних і гнилісних процесів слизових оболонок усього шлунково-кишкового тракту, сечостатевої й дихальної системи. Специфічним для А-авітамінозу є ксерофтальмія - ураження очного яблука внаслідок закупорки сльозного каналу, епітелій якого також піддається ороговінню.

Робота 2. Виявлення вітаміну D. Анілінова проба.

Принцип методу. Вітамін D при взаємодії з аніліновим реактивом при нагріванні забарвлюється в червоний колір.

Хід роботи. В суху пробірку вносять 3-5 крапель риб'ячого жиру і 5 крапель хлороформу, перемішують та додають 1 мл суміші аніліну та концентрованої соляної кислоти (НСl) (15:1). При нагріванні жовта емульсія набуває червоного забарвлення. Через 1-2 хв. емульсія розділяється на два шари, з яких нижній забарвлений в інтенсивний червоний колір.

Клініко-діагностичне й практичне значення. Активна форма вітаміну D - 1,25-дигідроксикальциферол підтримує постійний рівень кальцію й фосфору в крові. Вітамін D стимулює всмоктування кальцію й фосфору в кишечнику, сприяє посиленню тканинного дихання й окисного фосфорилювання, а також окисленню вуглеводів до лимонної кислоти; стимулює мобілізацію кальцію з кісткової тканини.

Нестача вітаміну D у раціоні дітей приводить до розвитку рахіту - захворювання, в основі якого лежать зміни обміну фосфору й кальцію, порушення відкладення їхніх солей на колагенову основу кісток, які ростуть. В результаті розвивається остеомаляція - розм'якшення кісток. Для D-авітамінозу

дорослих характерним є розвиток остеопорозу внаслідок вимивання солей кальцію й фосфору, кістки стають крихкими й це часто призводить до переломів.

Робота 3. Виявлення вітаміну Е. Реакція з азотною кислотою (HNO₃).

Принцип методу. Оскільки продукт окислення токоферолу має хіноїдну структуру, то при взаємодії спиртового розчину токоферолу з концентрованою азотною кислотою (НЮз) реакційна суміш забарвлюється в червоний колір. Цю реакцію використовують для кількісного визначення вітаміну.

Хід роботи. В пробірку вносять 5 крапель 0,1% розчину α-токоферолу (вітаміну Е), додають декілька кришталиків сахарози і 10 крапель концентрованої азотної кислоти (HNO_?). Перемішують скляною паличкою. Утворюється емульсія, яка поступово забарвлюється в червоний колір.

Клініко-діагностичне й практичне значення. Вітамін Е (токоферол) є потужним і основним антиоксидантом. Його дія спрямована на посилення тканинного дихання і підтримання на постійному рівні вільно-радикального пероксидного окислення. Опосередковано як кофактор вітамін Е бере участь у транспорті електронів і протонів у дихальному ланцюзі, стимулює синтез убіхінону.

Токоферол служить "пасткою" для вільних радикалів - утворює із ними неактивні форми, які обривають вільно-радикальний ланцюг. Цим вітамін Е захищає від пероксидного окислення поліненасичені жирні кислоти в складі клітинних мембран. Гіповітаміноз супроводжується патологією мембран у вигляді пероксидного гемолізу еритроцитів, розсмоктування плоду під час вагітності, м'язової дистрофії, некрозу печінки, розм'якшення мозку, атрофії сім'янників, що приводить до безплідності.

Робота 4. Виявлення вітаміну К. Реакція з лужним розчином цистеїну.

Принцип методу. При наявності цистеїну вікасол (вітамін К) в лужному середовищі забарвлюється в лимонно-жовтий колір.

Хід роботи. У пробірку вносять по 5 крапель розчинів вікасолу та цистеїну і 5 мл 10% розчину їдкого натру (NaOH). Спостерігають за появою лимонно-жовтого забарвлення.

Клініко-діагностичне й практичне значення. Цей вітамін є антигеморагічним фактором і має пряме відношення до згортання крові. Роль у вітаміну К у згортанні крові зумовлена його участю в утворенні протромбіну, який є неактивним попередником ферменту тромбіну, що перетворює білок плазми крові фібриноген у фібрин. Фібрин є нерозчинним волокнистим білком, що приймає участь в утворенні кров'яного згустка. Для того, щоб протромбін міг активуватися і перетворитися на тромбін, він спершу повинен зв'язати іони Са²⁺. Нормальна молекула протромбіну містить декілька залишків особливої амінокислоти - γ-карбоксиглутамінової кислоти, яка й зв'язує іони Са²⁺. При нестачі вітаміну К місце залишків γ-карбоксиглутамінової кислоти займають залишки звичайної глутамінової кислоти. Відтак, порушується каскад згортання крові і, як наслідок, підвищується кровотеча.

Тема заняття № 14. Дослідження фізіологічних та біохімічних функцій крові: буферні системи, кислотно-основний стан. Патологічні форми гемоглобінів.

Цілі заняття

• Пояснювати значення фізіологічних і біохімічних функцій крові.

• Пояснювати механізм участі гемоглобіну в транспорті кисню і діоксиду вуглецю в легеневих капілярах і капілярах периферичних тканин.

• Класифікувати молекулярні форми гемоглобінів в еритроцитах здорової людини і пояснювати виникнення патологічних форм гемоглобінів, їх оцінка в діагностиці патологічних станів.

• Використовувати результати біохімічного аналізу крові (норма і патологія) для оцінки стану здоров'я людини, механізму регуляції та підтримки кислотно-основного стану.

• Трактувати норму та молекулярно-біохімічні механізми виникнення патологічних форм гемоглобінів та зміну основних біохімічних показників біохімії крові для діагностики функціонального стану організму людини.

Теоретичні питання

1. Кров - внутрішнє середовище організму. Роль крові в підтриманні гомеостазу.

• Склад крові, плазми, сироватки крові. Фізико-хімічні і біологічні властивості крові.

• Об'єм крові, рН крові. Форменні елементи крові: еритроцити, лейкоцити, тромбоцити. Норма і патологія.

2. Гемоглобін, його структура, властивості, види.

3. Патологічні стани гемоглобіну: гемоглобінопатії і таласемії.

4. Дихальна функція еритроцитів в легеневих капілярах та тканинах.

• Ефект Бора.

• Залежність ступеня оксигенації від парціального тиску кисню. S-подібна кінетика дисоціації оксигемоглобіну.

5. Кислотно-основний стан. Регуляція рН рідин в організмі:

• Порушення кислотно-основного стану: ацидоз метаболічний (кетоацидоз, лактат ацидоз, гломерулярний ацидоз) та респіраторний; алкалоз (метаболічний та респіраторний). Причини їх виникнення.

• Р оль нирок, органів дихання, тканин в регуляції кислотно-основного стану:

6. Буферні системи крові, їх види:

• роль буферних систем крові в підтриманні постійності рН крові;

• функції гідрокарбонатної, фосфатної, гемоглобінової та білкової буферних систем в організмі людини.

7. Основні типи гіпоксії, механізм їх виникнення, прийоми лабораторної діагностики:

• гіпоксія викликана зниженням рО₂ в повітрі, що вдихається (екзогенна гіпоксія);

• гіпоксія викликана порушенням постачання тканин киснем внаслідок розвитку патологічного процесу ( легеневий тип, серцево-судинний, тканинний і немічний).

8. Роль системи ренін-ангіотензин в регуляції осмотичного тиску.

9. Гормони - регулятори осмотичного тиску крові.

10. Залежність біохімічних показників крові від метаболічних процесів в організмі.

11. "Загальний аналіз" крові і „біохімія" крові. Що входить в цей зміст?

Практичні роботи

Завдання 1. Визначення гемінової групи гемоглобіну бензидиновою пробою.

Принцип методу. Для визначення гемінової групи використовують бензидинову пробу, яка базується на каталітичних властивостях похідних гемоглобіну (оксигемоглобіну, карбоксигемоглобіну ).Продукт окислення бензидину має синій колір, який поступово може переходити в червоний. Проба дуже чутлива.