ВУЗ: Не указан
Категория: Не указан
Дисциплина: Не указана
Добавлен: 31.10.2019
Просмотров: 5024
Скачиваний: 1
препаратов
.
Каплю
полученного
серозного
экссудата
помещают
в
центре
тонкого
обезжиренного
предметного
стекла
и
покрывают
покровным
стек
-
лом
.
При
этом
капля
не
должна
выходить
за
пределы
покровного
стекла
.
Между
линзой
темнопольного
микроскопа
и
покровным
стеклом
помеща
-
ют
маленькую
каплю
иммерсионного
масла
,
с
которой
и
контактирует
линза
микроскопа
.
Яркого
освещения
препарата
добиваются
поворотами
зеркала
и
движениями
тубуса
микроскопа
.
В
темном
поле
должны
поя
-
виться
движущиеся
светящиеся
частицы
,
эпителиальные
клетки
,
лейкоциты
.
Бледная
трепонема
выглядит
в
виде
тонкой
спирали
или
тонкого
нежного
пунктира
,
с
серебристым
оттенком
.
Она
совершает
плавные
движения
.
Tr. pallidum
следует
отличать
от
Tr. refringens,
которая
может
встречаться
на
половых
органах
,
и
в
полости
рта
.
Последняя
выглядит
более
толстой
,
имеет
широкие
,
грубые
,
неравномерные
завитки
(5–7
завитков
),
отличается
резкими
беспорядочными
движениями
.
Метод
полимеразной
цепной
реакции
(
ПЦР
)
позволяет
выявить
единственную
молекулу
ДНК
бледной
трепонемы
среди
сотен
тысяч
дру
-
гих
молекул
.
Метод
ПЦР
,
предложенный
в
1983
г
.
лауреатом
Нобелевской
премии
(1995) Kary Mullis,
заключается
в
амплификации
(
размножении
)
в
пробирке
определенных
участков
ДНК
возбудителя
в
процессе
повто
-
ряющихся
температурных
циклов
.
На
каждом
этапе
вновь
синтезирован
-
ные
молекулы
копируются
ферментом
ДНК
-
полимеразой
,
благодаря
чему
происходит
многократное
удвоение
специфических
фрагментов
ДНК
.
Метод
включает
этапы
денатурации
ДНК
,
отжига
праймеров
и
элонгации
,
или
синтеза
.
Детекция
полученных
фрагментов
ДНК
проводится
методом
электрофореза
в
агаровом
геле
(
т
.
е
.
разделение
молекул
ДНК
по
молеку
-
лярному
весу
).
ПЦР
-
тест
для
выявления
ДНК
бледной
трепонемы
был
раз
-
работан
в
1991
году
.
Метод
ПЦР
является
высоко
специфичным
,
чувстви
-
тельным
и
воспроизводимым
,
при
грамотном
техническом
исполнении
и
хорошей
подготовке
образцов
он
практически
не
дает
ложных
результа
-
тов
и
очень
оправдан
для
диагностики
сифилиса
при
небольшом
количест
-
ве
трепонем
в
исследуемом
материале
,
что
особенно
ценно
при
диагности
-
ке
врожденного
сифилиса
.
И
хотя
у
ПЦР
пока
исследовательский
статус
,
но
уже
в
недалеком
будущем
эта
реакция
должна
стать
ведущим
лабора
-
торным
тестом
в
диагностике
сифилиса
.
Метод
ДНК
-
зондирования
,
или
гибридизации
нуклеиновых
кислот
базируется
на
использовании
,
как
и
в
методе
ПЦР
,
искусственно
синтези
-
рованных
нуклеотидов
,
которые
называются
не
праймерами
,
а
зондами
.
Вначале
из
образцов
клинического
материала
выделяют
ДНК
,
потом
ее
кипятят
(
денатурируют
)
и
фиксируют
на
нитроцеллюлозном
фильтре
.
Затем
идет
этап
гибридизации
с
ДНК
-
зондом
,
способным
специфически
гибридизироваться
с
ДНК
искомого
возбудителя
.
На
концах
зонда
имеют
-
ся
метки
в
виде
сульфоновых
групп
или
биотина
,
против
которых
имеются
71
моноклональные
антитела
.
После
окончания
гибридизации
фильтр
прояв
-
ляют
иммуноферментным
методом
путем
последовательного
добавления
конъюгата
и
субстрата
.
Окрашивание
в
соответствующих
точках
свиде
-
тельствует
о
наличии
тестируемой
ДНК
в
исследуемом
образце
.
Заражение
сифилисом
лабораторных
животных
как
метод
прямой
детекции
бледной
трепонемы
уже
давно
не
применяется
для
клинической
лабораторной
диагностики
сифилиса
из
-
за
дороговизны
,
трудоемкости
,
длительности
получения
результата
,
необходимости
содержания
вивария
.
Наиболее
чувствительным
и
удобным
лабораторным
животным
для
при
-
вития
сифилиса
является
кролик
.
В
настоящее
время
он
используется
только
в
крупных
исследовательских
центрах
в
качестве
«
золотого
стан
-
дарта
»
для
оценки
чувствительности
других
тестов
.
2.12.2.
С
ЕРОЛОГИЧЕСКИЕ
МЕТОДЫ
ДИАГНОСТИКИ
СИФИЛИСА
История
серологической
диагностики
сифилиса
берет
свое
начало
с
работы
А
.Wasserman,
А
. Neisser,
С
. Bruck,
опубликованной
10
мая
1906
г
.
Это
была
реакция
связывания
комплемента
,
которая
,
по
мнению
авторов
,
могла
оказаться
полезной
для
оценки
состояния
иммунитета
у
больных
сифилисом
,
так
как
в
качестве
антигена
исследователи
использовали
водную
вытяжку
из
печени
сифилитического
плода
,
полагая
,
что
там
содержится
много
бледных
трепонем
.
А
. Wasserman
и
соавторы
не
могли
в
1906
г
.
использовать
в
качестве
антигена
культуру
бледной
трепонемы
,
так
как
она
впервые
была
получена
только
в
1909
г
.
Реакция
основана
на
феномене
связывания
комплемента
(
реакция
Борде
–
Жангу
)
и
выявляет
фактически
аутоиммунный
процесс
,
определяя
антитела
классов
IgM
и
IgG
(
реагины
)
к
липидам
макроорганизма
(
кардиолипин
,
лецитин
,
холестерин
),
высвобождающимся
из
поврежденных
бледной
трепонемой
клеток
и
тка
-
ней
и
имеющими
перекрест
с
липидными
антигенами
бледной
трепонемы
.
Исторически
это
был
первый
нетрепонемный
серологический
тест
на
си
-
филис
,
известный
в
литературе
(
и
в
народе
)
как
реакция
Вассермана
(
РВ
)
.
Серологическими
методами
выявляются
антитела
к
бледной
трепоне
-
ме
.
Эти
методы
подразделяются
на
нетрепонемные
(
скрининговые
)
и
тре
-
понемные
(
диагностические
).
Нетрепонемные
тесты
делятся
на
реакцию
связывания
комплемента
(
РСК
)
—
реакцию
Вассермана
с
липидными
антигенами
и
флокуляционные
реакции
:
реакция
Канна
,
цитохолевая
реакция
Закс
-
Витебского
,
микроре
-
акция
преципитации
(
МРП
), VDRL, RPR, USR, TRUST.
С
помощью
этих
тестов
выявляются
IgM
и
IgG
антитела
(
реагины
)
к
липидам
клеточной
стенки
бледной
трепонемы
,
которые
появляются
в
крови
в
количестве
дос
-
таточном
для
определения
этими
реакциями
примерно
через
неделю
после
появления
твердого
шанкра
.
Говоря
о
сроках
появления
в
крови
антител
к
бледной
трепонеме
,
следует
напомнить
,
что
антитела
класса
IgM
появ
-
72
ляются
уже
через
2
недели
после
заражения
,
а
антитела
класса
IgG
начи
-
нают
синтезироваться
в
организме
больного
лишь
спустя
4
недели
после
заражения
.
Серологические
тесты
на
наличие
антител
(
реагинов
)
к
кардио
-
липину
могут
выявляться
и
при
других
физиологических
и
патологических
состояниях
и
могут
давать
ложноположительные
результаты
на
сифилис
.
Поэтому
эти
реакции
называют
нетрепонемными
,
и
они
служат
в
каче
-
стве
первичных
скрининговых
тестов
на
сифилис
.
Скрининговые
тесты
имеют
свои
плюсы
и
минусы
.
К
плюсам
нетре
-
понемных
тестов
можно
отнести
их
невысокую
стоимость
,
сравнительно
короткое
время
для
получения
ответа
при
постановке
отдельных
тестов
,
пригодность
для
проведения
скрининга
большого
количества
образцов
.
Кроме
того
,
ряд
современных
нетрепонемных
тестов
выпускаются
уже
стандартизированными
.
К
минусам
большинства
нетрепонемных
тестов
относят
их
сравнительно
низкую
чувствительность
при
первичном
(70–
90 %)
и
позднем
(30–50 %)
сифилисе
,
наличие
феномена
прозоны
в
от
-
дельных
случаях
(
появление
ложноотрицательных
или
слабоположитель
-
ных
результатов
при
наличии
избыточного
количества
антител
в
неразве
-
денной
исследуемой
сыворотке
(
блокировка
реакции
антиген
-
антитело
),
в
то
время
как
при
разведении
исходной
сыворотки
получаются
резкопо
-
ложительные
результаты
);
сложность
,
громоздкость
и
длительность
поста
-
новки
РСК
.
В
настоящее
время
считается
,
что
положительные
результаты
нетрепонемных
тестов
не
могут
считаться
достаточными
для
постановки
диагноза
сифилитической
инфекции
без
дополнительного
подтверждения
в
трепонемных
тестах
.
Нетрепонемные
тесты
дают
ложноположительные
результаты
до
2,5 %,
чаще
у
женщин
.
Основными
причинами
ложноположительных
нетрепонем
-
ных
тестов
являются
:
аутоиммунные
заболевания
(
ревматизм
,
системная
красная
волчанка
,
системная
склеродермия
,
узелковый
периартериит
,
кри
-
оглобулиновая
пурпура
,
саркоидоз
),
онкологические
заболевания
и
болезни
крови
,
некоторые
вирусные
и
бактериальные
инфекции
,
малярия
,
цирроз
печени
,
наркомания
,
алкоголизм
,
беременность
,
эндокринные
заболевания
(
сахарный
диабет
,
аутоиммунный
тиреоидит
),
старческий
возраст
и
др
.
Наиболее
известными
нетрепонемными
тестами
с
визуальной
рас
-
шифровкой
результатов
исследования
являются
:
1.
Реакция
связывания
комплемента
с
кардиолипиновым
антигеном
(
РСКк
).
2.
Микрореакция
преципитации
(
МРП
)
с
плазмой
или
инактивиро
-
ванной
сывороткой
.
3.
RPR —
тест
быстрых
плазменных
реагинов
(Rapid Plasma Reagins).
4.
TRUST-
тест
с
толуидиновым
красным
и
непрогретой
сывороткой
(Toluidin Red Unheated Serum Test).
73
Среди
нетрепонемных
тестов
имеются
2
теста
с
микроскопическим
считыванием
результатов
реакции
:
1.
VDRL — Venereal Disease Research Laboratory;
2.
USR —
тест
определения
активных
реагинов
плазмы
(Unheated
Serum Reagins).
В
Республике
Беларусь
к
классическим
(
стандартным
)
серологиче
-
ским
реакциям
относится
КСР
.
Этот
комплекс
реакций
включает
в
себя
ре
-
акцию
связывания
комплемента
с
кардиолипиновым
(
экстракт
из
сердца
быка
,
обогащенный
лецитином
и
холестерином
)
и
трепонемным
антигеном
(
обработанная
ультразвуком
взвесь
апатогенных
культуральных
бледных
трепонем
),
а
также
микрореакцию
преципитации
с
плазмой
или
инактиви
-
рованной
сывороткой
.
Реакция
связывания
комплемента
с
кардиолипиновым
антигеном
основана
на
реакции
связывания
комплемента
Борде
–
Жангу
.
У
больного
сифилисом
кардиолипиновый
антиген
соединяется
с
реагинами
сыворотки
крови
,
образуя
иммунный
комплекс
,
способный
адсорбировать
и
связывать
комплемент
,
а
индикация
образования
этого
комплекса
(
реагины
–
антиген
–
комплемент
)
проводится
с
помощью
гемолитической
системы
,
которая
представляет
собой
оттитрованную
смесь
эритроцитов
барана
и
гемолити
-
ческой
сыворотки
.
У
больного
сифилисом
комплемент
связан
реагинами
и
поэтому
комплекс
«
эритроциты
барана
+
гемолитическая
сыворотка
+
комплемент
»
образоваться
не
может
и
эритроциты
барана
выпадают
в
оса
-
док
(
т
.
е
.
реакция
положительная
).
У
здорового
человека
комплемент
не
связан
в
первой
фазе
реакции
,
поэтому
при
добавлении
гемолитической
системы
свободный
комплемент
ею
связывается
и
происходит
гемолиз
эритроцитов
барана
,
при
этом
степень
выраженности
гемолиза
определя
-
ется
визуально
и
оценивается
крестами
(4+ —
полное
отсутствие
гемолиза
,
т
.
е
.
реакция
резкоположительная
; 3+ —
значительная
задержка
гемоли
-
за
—
реакция
положительная
; 2+ —
значительный
гемолиз
—
реакция
сла
-
боположительная
; ± —
незначительная
задержка
гемолиза
,
незначительная
мутность
содержимого
пробирки
—
реакция
сомнительная
;
полный
гемо
-
лиз
—
реакция
отрицательная
.
У
больных
с
резкоположительной
реакцией
(4+)
ставится
количественный
метод
Боаса
,
что
достигается
ступенчатым
разведением
сыворотки
(1:10, 1:20, 1:40, 1:80
и
т
.
д
.).
При
этом
титр
реаги
-
нов
определяется
наибольшим
разведением
сыворотки
,
в
котором
регист
-
рируется
положительный
результат
.
Знание
титра
антител
имеет
сущест
-
венное
значение
в
диагностике
клинических
форм
сифилитической
инфек
-
ции
.
Титр
реагиновых
антител
снижается
после
адекватной
терапии
,
что
в
определенной
мере
позволяет
судить
об
эффективности
лечения
.
Моди
-
фикация
реакции
Вассермана
на
холоде
оказалась
более
чувствительной
,
чем
в
классической
постановке
.
74
Реакция
Вассермана
с
двумя
антигенами
становится
положительной
на
5–6-
й
неделе
после
заражения
у
25–60 %
больных
,
на
7–8-
й
неделе
—
у
75–96 %,
на
9–16-
й
неделе
—
у
100 %
пациентов
.
По
мере
развития
си
-
филитической
инфекции
титр
реагинов
нарастает
и
достигает
максимума
(1:160–1:640
и
выше
)
у
больных
вторичным
свежим
сифилисом
,
т
.
е
.
с
дав
-
ностью
инфекции
9–12
недель
.
По
мере
«
старения
»
инфекции
титры
анти
-
тел
снижаются
,
и
у
больных
вторичным
рецидивным
сифилисом
они
не
превышают
1:80–1:160.
При
раннем
скрытом
сифилисе
РВ
положительная
с
высокими
титрами
антител
(1:40–1:320
и
выше
)
у
100 %
больных
,
а
при
позднем
скрытом
сифилисе
титры
антител
обычно
не
превышают
1:10–
1:20.
Положительная
РВ
имеет
место
только
у
70 %
больных
третичным
сифилисом
с
титрами
антител
,
не
превышающими
1:20–1:80.
Поздние
формы
сифилиса
внутренних
органов
и
нервной
системы
проявляются
положительными
результатами
РВ
только
у
50–80 %
больных
,
а
титры
антител
весьма
вариабельны
—
от
низких
до
высоких
.
Основными
недостатками
реакции
Вассермана
,
кроме
сравнительно
низкой
чувствительности
и
наличия
ложноположительных
результатов
,
являются
сложность
постановки
,
необходимость
предварительной
подго
-
товки
исследуемых
сывороток
(
прогревание
)
и
тщательной
подготовки
ис
-
ходных
реагентов
(
титрование
комплемента
и
гемолитической
сыворотки
,
отмывка
эритроцитов
барана
,
разведение
кардиолипинового
антигена
).
Реагенты
и
саму
реакцию
сложно
стандартизировать
,
постановка
реакции
в
целом
весьма
трудозатратна
.
В
силу
вышесказанного
в
странах
Западной
Европы
и
Америки
реакцию
Вассермана
уже
давно
заменили
другими
стандартными
нетрепонемными
тестами
.
Микрореакция
с
кардиолипиновым
антигеном
(
МРП
)
внедрена
и
применяется
во
всех
серологических
лабораториях
Беларуси
с
1985
г
.
В
настоящее
время
она
используется
как
отборочный
тест
,
а
также
входит
в
состав
КСР
,
причем
в
количественной
постановке
она
применяется
при
обследовании
больных
сифилисом
в
процессе
и
после
окончания
лечения
.
МРП
ставится
или
с
инактивированной
сывороткой
крови
,
или
с
плазмой
в
день
взятия
крови
из
пальца
.
Реакция
ставится
в
качественном
и
количе
-
ственном
вариантах
.
Принцип
МРП
заключается
в
том
,
что
при
добавле
-
нии
эмульсии
кардиолипинового
антигена
к
плазме
или
сыворотке
крови
больного
сифилисом
образуются
хлопья
преципитата
белого
цвета
.
Результаты
реакции
оценивают
по
количеству
выпавшего
осадка
,
величине
хлопьев
и
выражаются
в
крестах
: 4+, 3+, 2+
и
отрицательная
.
Специфич
-
ность
МРП
составляет
98 %,
а
чувствительность
при
первичном
сифилисе
равна
81 %,
при
вторичном
— 91 %,
при
раннем
скрытом
— 94 %,
т
.
е
.
она
меньше
,
чем
у
других
стандартных
нетрепонемных
более
современных
тестах
,
например
— RPR.
75