Файл: LABORATORNI_ROBOTI.doc

Техніка визначення. До екстракту м’язів або сухого залишку додати по краплях концентровану азотну кислоту і потім нагріти до кипіння. Після охолодження обережно додати по краплях концентрований розчин їдкого натра або аміаку. При наявності циклічних амінокислот з’являється оранжево-червоне забарвлення.

Провести експеримент з дослідним зразком. Результати експерименту занести у форму 6, зробити короткий висновок.

9.4. Якісна реакція на триптофан з гліоксілевою кислотою

Біохімічне підґрунтя. Кольорова реакція на триптофан відбувається в наслідок взаємодії триптофану з глиоксилевою кислотою (СОНСООН), яка знаходиться у вигляді домішки в льодяній оцтовій кислоті. Тому замість льодяної оцтової кислоти для реакції можна використовувати розчин чистої гліоксілевої кислоти. Сліди міді в реакції значно підвищують інтенсивність утвореного забарвлення.

Техніка визначення. До екстракту м’язів додати в надлишку льодяну оцтову кислоту, підігріти до повного розчинення і після охолодження обережно додати концентровану сірчану кислоту. На межі двох шарів після деякого відстоювання з’являється червоно-фіолетове забарвлення.

9.5. Якісна реакція на аміак

Біохімічне підґрунтя. Реакція дозволяє виявити аміак чи солі його в екстракті м’язів в кількості, що перевищує природну концентрацію. Метод ґрунтується на зміні кольору екстракту при взаємодії аміаку з реактивом Неслера.

Техніка визначення. У хімічну склянку відмірюють 2 мл екстракту м’язів і додають 1 мл реактиву Неслера. Суміш ретельно перемішують протягом 1 хв. Спостерігають за зміною забарвлення. При наявності у м’ясі кінцевого продукту розпаду білка (аміаку) в надпорогових концентраціях колір рідини змінюється на жовто-гарячий.

Таблиця 16

Якісне відкриття окремих азотовмісних сполук у м'ясі

Назва якісної реакції	Матеріал дослідження	Реактиви	Результати дослідження	Висновки

9.6. Фракціонування білків водного екстракту м'язів

Техніка визначення. Подрібнити і екстрагувати поперечносмугасті м’язи 4-х кратним обсягом дистильованої води при співвідношенні 1:2 (через годину після забою тварини!). Через 40-60 хв. рідину відфільтрувати через марлю і залишок злегка віджати. В отриманому прозорому екстракті визначити рН, а потім у 10 мл екстракту знаходять вміст загального азоту і білкового азоту (осадженням трихлороцтовою кислотою). Як правило, у 10 мл екстракту входять близько 36 мг загального і 23 мг білкового азоту (при відношенні 1:4 у 10 мл водного екстракту міститься близько 15 мг загального і близько 9,5 мг білкового азоту). Як правило, азот водного екстракту складається з 60—70% білкового і 30—40% залишкового азоту.

Отриманий водний екстракт охолодити в холодильній камері до ±1°С и потім змішати з охолодженими до тієї ж температури метиловим спиртом і водою за наступним розрахунком:

10 мл водяного екстракту + (90—А) мл води + А мл метилового спирту

У такий спосіб одержати ряд сумішей із вмістом метилового спирту від 10 до 90 об’ємних %. Отримані суміші залишити в холодильній камері при ±1°С на дві години, після чого білкові осади відфільтрувати при тій же температурі, промити відповідною сумішшю метилового спирту і води і визначити після мінералізації вміст азоту в отриманих осадах. Це осадження білкового азоту корисно використовувати для визначенням вмісту азоту у відповідних фільтратах.

Отримані результати віднести до білкового азоту в 10 мл вихідного екстракту і, таким чином, одержати кількість осадженого білка (при тій чи іншій концентрації метилового спирту) у відсотках до загального вмісту білкового азоту.

Метиловий спирт (об’ємні %) (А)	10 15 20 25 30 35 45 50 60 70 80 90
Осаджений білковий N у % до вихідного	23 24 29 31 32 33 43 51 78 92 97 99

Цифрові результати зобразити графічно, відкладаючи по осі абсцис вміст метилового спирту в об’ємних відсотках, а осі ординат - осаджений білковий азот у відсотках до всього білкового азоту екстракту. Одержати криву, яка показує, що водні екстракти скелетних м’язів містять дві основних білкових фракції: що легше осаджується і цілком випадає до 25-30 об’ємних % метилового спирту (глобулін X) і важче осаджується, що випадає до 80 об’ємних % спирту (міоген).

9.7. Одержання міозину м'яса

Техніка визначення. М’ясо щойно убитої тварини ретельно подрібнити, прохолоджуючи льодом. 100 г здрібненого м’яса екстрагувати 300 мл 0,15 М фосфатного буфера з рН 6,5, що містить хлористий калій у 0,3 М концентрації. Екстрагування вести, перемішуючи при ±1⁰С протягом 10 хв. Суміш розвести додаванням 1000 мл води кімнатної температури, відразу профільтрувати і віджати через марлю. Фільтрат перемішувати мішалкою доти, доки не відбудеться випадання осаду актоміозину (одна-дві години). Осад, що випав, видалити центрифугуванням, після чого до опалесцентної рідині при постійному перемішуванні протягом 10 хв. додати 1500 мл води, охолодженої до 0°С. Після двогодинного стояння при 0°С частину рідини злити і потім осад міозину відокремити центрифугуванням. Дослідити розчинність отриманого міозину і визначити його ізоелектричну точку .

9.8. Визначення вмісту азотистих речовин у м'ясі

Азотисті речовини поєднують під загальною назвою «протеїн», до якого належать білок і азотисті сполуки небілкового характеру (аміди).

Аміди являють собою органічні азотисті сполуки небілкового характеру, що включають, крім вільних амінокислот, їх аміди, азотовмісні глюкозиди, органічні основи та амонійні речовини.

Полумікрометод визначення азоту за Кьельдалем

Біохімічне підґрунтя. Жири і вуглеводи під час нагрівання з концентрованою сірчаною кислотою руйнуються до вуглекислого газу і води, а азотовмісні речовини розпадаються до аміаку NНз, що з'єднується із сірчаною кислотою й утворює нелетку сіль — сірчанокислий амоній.

Реакція протікає за наступним рівнянням:

2NНз+ Н₂S0₄(NН₄)₂S0₄

У процесі перегонки у середовищі з надлишком лугу виділяється аміак:

(NН₄)₂SО₄ + 2NаОН Nа₂SО₄ + 2NН₄ОН

2NН₄ОН + 2NНз + 2Н₂О.

Аміак, що виділяється у ході реакції, вступає у реакцію з борною кислотою й утворює сіль. Вміст прийомної колби титрують 0,1 н. розчином соляної кислоти, яка з'єднується з іонами амонію, утворюючи хлористий амоній і витісняючи борну кислоту.

За кількістю 0,1 н. розчину НСl, яка пішла на титрування, визначають кількість азоту в субстраті. Відомо, що 1 мл 0,1 н. розчину соляної кислоти відповідає 0,0014 г азоту.

Техніка визначення. Для аналізу беруть тонко розмелене сухе м'ясо — 0,1 г, сало — по 0,2—0,3 г. Важливо, щоб у цій кількості досліджуваного зразка містилося 0,5—1,5 мг азоту.

1. Наважку озолюють (спалюють) у колбі Кьельдаля, застосовуючи сірчану кислоту і каталізатор. Для спалювання м'яса беруть до 5 мл кислоти, для спалювання інших речовин — 3—4 мл, каталізатора — близько 200 мг. Спалюють до просвітління рідини.

2. Вміст колби охолоджують, розводять 10—15 мл дистильованої води і кількісно переносять у мірну колбу на 100 мл, додають дистильованої води до мітки і ретельно перемішують.

3. Для відгону беруть 20 мл розчину і додають його у відгоночну колбу апарата Парнаса, додають 15 мл 30 %-ного розчину лугу і пропускають сильний струмінь пари.

4. Перед уливанням лугу у відгінну колбу під вивідну трубку холодильника відгоночного приладу ставлять конічну колбу з 10 мл 2 %-ного розчину борної кислоти, до якої додають 6—8 крапель індикатора Таширо.

5. Відгін проводять протягом 15—30 хв. у залежності від інтенсивності струменя пари. Необхідно зібрати близько 50 мл дистиляту. Закінчення відгону аміаку встановлюють нанесенням краплі дистиляту на червоний лакмусовий папір. Відгін доцільно проводити одночасно у двох приладах, поміщаючи в них рівноцінні проби з одного зразка.

6. Після закінчення відгону наконечник форштосса холодильника зовні й усередині обмивають невеликою кількістю дистильованої води і вмістиме колби титрують з 5-мілілітрової мікробюретки 0,1 н. чи 0,05 н. розчином НС1 до переходу забарвлення з зеленого у червоне.

7. Паралельно проводять контрольну (холосту) пробу. Виконують усі зазначені вище операції, крім перенесення наважки зразка в колбу Кьельдаля.

Кількість кислоти, яка пішла на титрування дистиляту в холостій пробі, віднімають від результатів титрування дослідних зразків.

8. За витраченим на титрування обсягом кислоти обчислюють зміст азоту в наважці в грамах і відсотках, 1 мл 0,1 н. розчину соляної кислоти відповідає 0,0014 м азоту.

Розрахунок ведуть за кількістю 0,1 н. кислоти, яка пішла натитрування: