Файл: chastnaya_sanitarnaya_mikrobiologia.docx

Патологический материал: свежие трупы, клинически больные кролики, а также кусочки пораженной кожи и подкожной клетчатки.

Схема лабораторной диагностики.

I. Экспресс-методы: гистологические исследования и ИФА.

II. Вирусологические исследования: 1) выделение вируса на кроликах или на куриных эмбрионах; 2) идентификация выделенного вируса в ИФА.

Специфическая профилактика. За рубежом и в РФ используют живые вакцины, скармливая ее пчелам.

Ветеринарно-санитарная оценка и мероприятия. При обнаружении нитевидного вируса пасеку объявляют неблагополучной и назначают карантин. По требованиям и условиям карантина запрещается вывоз из пасек в другие хозяйства пчелиных семей, маток, а также продуктов пчеловодства, предназначенных для использования на пасеках, и кочевка неблагополучной пасеки. Мед, полученный от пчелиных семей неблагополучных пасек, хранят в закрытой посуде. Использовать его для подкормки пчел запрещается. Собирают погибших пчел и выброшенный расплод для сжигания. Проводят дезинфекционные работы и противороевые меры. Для профилактики используют эндонуклеазу бактериальную.

Глава 8. Прионные болезни

1. Общая характеристика прионов

В конце ХХ в. кроме известных микроорганизмов, в том числе и вирусов, вызывающих инфекционные болезни макроорганизмов, был обнаружен возбудитель заболеваний нервной системы животных и людей. Американский биохимик Прузинер (1982) на основании результатов исследований установил, что возбудитель не имеет нуклеиновых кислот и состоит из низкомолекулярного белка (27-30 кД), который он назвал инфекционным прионным белком. В качестве инфекционной единицы Прузинер предложил название «прион». Термин «прион» образован из английских слов proteinaceons infections particles – белковая инфекционная частица. В очищенных препаратах прион имел палочковидные структуры (фибриллы) диаметром 10-20 нм и длиной 100-200 нм, которые состояли примерно из 1000 молекул прионного белка.

Установлено, что нормальный (клеточный) прионный белок синтезируется во многих органах и тканях человека и животных. Назначение приона изучено недостаточно, но полагают, что он необходим для функционирования нейронов, межклеточного узнавания и клеточной активации и т.д. Ген, кодирующий синтез прионного белка, картирован в 20 хромосоме у человека, во 2 – у мыши и в 14 – у серебристо-черной лисицы. Ген (прионного белка крысы имеет 1600 пар нуклеотидов) представляет мозайчатую структуру и состоит из экзонов и интронов. Он транскрибируется полностью с образованием предшественника иРНК, из каждой удаляются интроны, а экзоны соединяются и формируется зрелая иРНК, которая транспортируется в цитоплазму и на рибосомах обеспечивает синтез белка. Длина молекулы белка у человека и различных животных составляет 252-264 аминокислотных остатков.

Нормальный прионный белок превращается в инфекционный прионный белок следующим образом: 1) спонтанно; 2) под воздействии экзогенного инфекционного прионного белка; 3) при мутациях в кодирующей части гена прионного белка.

Инфекционный прионный белок обладает высокой устойчивостью к неблагоприятным факторам внешней среды (повышенная температура, ультрафиолетовые лучи, свет, ионизирующая радиация, дезинфектанты и др.).

Инфекционный прионный белок у животных вызывает следующие болезни: скрепи овец и коз, трансмиссивную энцефалопатию норок, губкообразную энцефалопатию крупного рогатого скота, хроническую изнуряющую болезнь оленей и лосей, губкообразную энцефалопатию кошек и экзотических животных. Заболевание происходит в возрасте от 16 до 40 лет.

Патогенез прионных болезней на примере скрепи овец происходит следующим образом: оральная инфекция → репликация в мононуклеарных фагоцитах → отсутствие иммунного ответа → распространение с кровотоком → внедрение в центральную нервную систему (ЦНС) → репликация в ЦНС → индукция амилоидоза → дегенерация нервной ткани → клинический симптомокомплекс → смерть.

Сложность диагностики прионных болезней заключается в следующем: ретроспективная диагностики невозможна, поскольку у больных животных к возбудителю не образуются антитела; иммунизация лабораторных животных прионом с целью получения гипериммунных диагностических антисывороток малоэффективно, поскольку прионные белки разных видов животных имеют почти одинаковую структуру и поэтому трудно получить антисыворотки с необходимым титром антител; отсутствуют методы прижизненной диагностики прионных болезней, т.к. основная масса возбудителя локализована в продолговатом мозгу животного и он не выделяется в спинно-мозговую жидкость, мочу или кровь в количествах, достаточных для его обнаружения.

Диагноз ставят на основании прижизненных клинических признаков и гистологических исследованиях головного мозга (посмертно). В качестве дополнительного приема пользуются микроскопией с целью обнаружения в экстрактах мозга больных животных фибрилл, ассоциированных со скрейпи.

Разработка прижизненных методов диагностики прионных заболеваний является целью многих исследователей во всем мире, но вместе с этим эта задача пока практически оказалась неразрешенной.

В настоящее время основным способом диагностики прионных заболеваний остается лабораторное исследование ткани головного мозга, прежде всего его стволовой части, как наиболее поражаемой.

Предложено и применяется ряд лабораторных методов посмертной диагностики болезней, вызванных прионами: прижизненная диагностика, гистопатологический метод, иммуногистохимический метод, иммунофлуоресцентный анализ, иммуноферментный метод, электронная микроскопия.

Прижизненная диагностика. Так как при жизни до сих пор не предложено специфических тестов для диагностики прионных заболеваний, ветеринарный врач должен обращать внимание, прежде всего, на клинический статус животных как перед отправкой их из хозяйства на убой, так и на самом мясокомбинате при приемке и перед подачей на переработку. Прежде всего, необходимо обращать на клинические признаки нейрологического характера.

Несмотря на характерную клиническую картину болезни. Прионные заболевания следует дифференцировать от ряда заболеваний инфекционной и незаразной этиологии, имеющих сходные клинические признаки.

В ранней стадии развития клинических признаков болезни ее, прежде всего, необходимо дифференцировать от классического бешенства, листериоза, нервных форм кетоза и различных отравлений. Как известно при острых инфекционных заболеваниях практически всегда отмечается подъем температуры и отсутствие аппетита, а, например, при губчатой энцефалопатии температура и аппетит сохраняются в норме на всем протяжении болезни. Кроме того, выделение возбудителя того или иного инфекционного заболевания дифференцируют их от прионных заболеваний.

Учитывается эпизоотическая ситуация.

Гистопатологический метод. В основе этого метода лежит обнаружение в головном мозге вакуолей. Метод заключается в обычном гистологическом исследовании препаратов мозга, где развивается патология прионной инфекции. Под микроскопом наблюдается ряд гистологических изменений: клеточные реакции (отсутствие воспаления), признаки церебрального милоидоза, в том числе образование характерных амилоидных бляшек. Совокупность этих признаков может быть использована для подтверждения клинического диагноза прионной инфекции.

Для получения окончательного результата с помощью данного метода требуется не менее 16 дней, из которых 14 дней уходит на фиксацию тканей. В связи с относительной простотой выполнения гистопатологического метода он является широко используемым методом диагностики.

Иммуногистохимический метод. Этот метод основан на обнаружении скоплений патогенной изоформы прионного белка в перикорионных и отростках нейронов, а также скоплений между глиальными клетками. Сначала проводится предварительная обработка препаратов с целью разрушения антигенности нормального приона и повышения ее у патогенного прионного белка. Стандартная процедура для этих целей включает инкубирование кусочков ткани в концентрированной муравьиной кислоте в течение 20 минут с последующим автоклавированием. Далее проводится обычная процедура иммуногистохимического окрашивания. Анализ препаратов позволяет обнаружить крупные рассеянные скопления патогенного прионного белка.

Учитывая сложность получения антисывороток к патогенным прионным белкам, обычно получают поликлональные антисыворотки к синтетическим пептидам или моноклональные антитела. В последние годы на их основе разработано несколько выскочувствительных методов (иммунофлуоресцирующий и иммуноферментный методы).

Иммунофлуоресцентный метод. Этот метод является одним из быстрых тестов, рекомендованных Европейской комиссией ЕЭС. Сущность метода состоит в следующем: участок головного или шейного отдела мозга массой 0,5 г гомогенизируют, обрабатывают в полиакриламидный гель. После элекрофоретического разделения белки распределяются на мембране и приона обнаруживают, используя запатентованные моноклональные антитела 6НЧ с последующей люминесцентной микроскопией. Чувствительность 100 %, продолжительность процедуры 7-8 часов.

Иммуноферментный метод. Суть заключается в следующем. От образца шейного отдела спинного мозга больных животных отбирают пробу массой 0,5 г, которую гомогенизируют, а затем подвергают обработке протеазой для разрушения нормального прионного белка. Затем пробы помещают в лунки плашек. После адсорбции наслаивают антитела к пептиду - фрагменту патогенного прионного белка, затем антитела, меченные пероксидазой. Хемилюминесцентный реагент взаимодействует с пероксидазой с образованием светового сигнала, интенсивность которого измеряют в хемилюминометре при длине волны 450 нм.

Образцы с оптической плотностью выше или равной пороговой величине (0,060+0,09=0,150) рассматриваются как исходно положительные и анализируются повторно в параллелях, прежде чем вынести окончательное заключение.

Ложноположительные реакции мозга были получены на основе недостаточно размельченных гомогенатов или приготовленных из неправильно хранившихся нервных тканей. Для увеличения эффективности этих диагностических методов в повседневную практику, необходимо усовершенствовать методы получения и оценки антисывороток и провести оценку методологии с целью ее стандартизации.

Электронно-микроскопический метод. При выполнении этого метода необходимо концентрирование патогенного прионного белка путем многократного высокоскоростного ультрацентрифугирования при 200000 д в течение 2 ч с последующей обработкой протеазой и оценкой под электронным микроскопом. Вся процедура занимает около 2 дней.

Биологические пробы. Биологические методы тестирования подразделяются на способы культивирования in vitro на клеточных культурах и животных. Биопроба на мышах пока единственный практический способ обнаружения инфекционных агентов, вызывающих трансмиссивную губкообразную энцефалопатию крупного рогатого скота и др.

Единственным способом, позволяющим определить степень инфекционности биологического материала, является его внутрицеребральная инокуляция лабораторным животным. Инфекционный титр можно определить по ЛД₅₀: эта техника может считаться высокочувствительной, поскольку с ее помощью можно обнаружить минимального количества патогенного прионного белка. Однако эта методика требует длительного времени (инкубационные периоды длятся несколько месяцев). Методика дорогостоящая и не дает 100 % гарантии. В действительности, штамм трансмиссивного возбудителя из-за видового различия может и не вызвать заболевания в экспериментальной модели с первого пассажа.