Файл: Practicum_po_microbiologii.doc

Бактериальные антигены, используемые для реакции преципитации, обладают устойчивостью к высокой температуре. Так, сибиреязвенный, чумной, туляремийный и другие антигены не разрушаются при кипячении в течение 45 минут, они сохраняются в гниющих субстратах.

Реакция преципитации применяется также в судебной медицине и ветеринарии для определения видовой принадлежности белка крови и в санитарной практике — для выявления фальсификации продуктов. В санитарной практике применяется для выявления фальсификации мясных, рыбных, мучных продуктов. Посредством этой реакции можно определить, из какого мяса (свиного, говяжьего, конины и др.) приготовлен тот или иной продукт.

Для ее проведения разработаны методы: кольцепреципитации, диффузной преципитации, диск-преципитации.

21.1. Реакция кольцепреципитации

Этот метод был разработан Асколи (1910) в основном для исследования кожевенного сырья на сибирскую язву. Эта реакция получила и другое название – асколизация кожевенного сырья.

Для ее проведения необходимы следующие компоненты:

1. Экстракт из исследуемого сырья. Исследуемые пробы кожи, нанизанные на проволоку, стерилизуют в автоклаве при 1,5 атм 30 минут. Пробы охлаждают, измельчают, помещают в баночки и заливают карболизированным физиологическим раствором (на 1 г сырья 10 мл экстрагента). Продолжительность экстрагирования от 16-20 ч (холодный способ).

Пробы от свиных шкур и мяса экстрагируют горячим способом в водяной бане в течение 30 минут.

Полученные пробы фильтруют через асбестовую вату. Экстракт из исследуемого сырья должен быть прозрачным.

В экстракте, полученном из кожсырья больных животных, содержится сибиреязвенный антиген.

2. Сибиреязвенную преципитирующую сыворотку получают путем гипериммунизации лошадей на биофабриках. Для этого лошадям-продуцентам внутривенно вводят многократно (16-17 раз) возбудитель сибирской язвы (антиген) с интервалом в три дня в нарастающих дозах с 5 до 70 мл. Предварительно до гипериммунизации лошадей вакцинируют для создания грунд-иммунитета.

Через 9-10 дн. после последнего введения антигена у лошадей берут кровь в количестве 5-6 литров и из нее получают преципитирующую сыворотку, которая содержит сибиреязвенные антитела. Эту полученную специфическую сыворотку консервируют 0,5%-ным раствором фенола и отстаивают в течение двух месяцев, фильтруют через стерилизующие пластины и расфасовывают в стерильные флаконы.

Для контроля используют следующие компоненты:

1. Специфический сибиреязвенный антиген биофабричного изготовления, который представляет собой обезвреженный экстракт, полученный из возбудителя сибирской язвы.

2. Нормальную сыворотку, полученную от здоровых животных, фабричного изготовления.

Методы постановки реакции преципитации

1. Метод наслаивания

В небольшие (уленгутовские) пробирки наливают около 0,3 мл преципитирующей сыворотки, затем осторожно по стенке пробирки наслаивают в таком же объеме исследуемый экстракт (антиген) так, чтобы была видна граница между двумя компонентами.

2. Метод подслаивания

В небольшие (уленгутовские) пробирки наливают около 0,3 мл исследуемого экстракта (антигена), затем под него подслаивают 0,3 мл преципитирующей сыворотки.

Положительная РП характеризуется появлением в первые 1-2 минуты на границе двух компонентов серо-белого кольца – преципитата, хорошо видимого на черном фоне в проходящем свете (рис. 61).

Проведение контролем:

1. Преципитирующая сыворотка + физраствор – отрицательная реакция.

2. Нормальная сыворотка + исследуемый антиген – отрицательная реакция.

3. Преципитирующая сыворотка + специфический антиген – положительная реакция.

Рис. 61. Реакция преципитации:

1 – преципитирующая сыворотка + исследуемый антиген; 2 – преципитирующая сыворотка + известный специфический антиген; 3 – преципитирующая сыворотка + контрольный экстракт без антигена; 4 – преципитирующая сыворотка + изотонический раствор; 5 – нормальная сыворотка + исследуемый антиген; 6 – нормальная сыворотка + контрольный экстракт без антигена

21.2. Реакция диск-преципитации

Эта реакция используется при диагностике сибирской язвы и дифференциации ее возбудителя от подобных ему сапрофитных микробов рода бациллус. Она основана на взаимодействии антигена – нативных продуктов метаболизма, растущего в жидкой питательной среде возбудителя сибирской язвы - с антителами преципитирующей сибиреязвенной сыворотки в слое агарового геля. При этом происходит образование диска преципитации в слое агарового геля, расположенного между антигеном и сывороткой.

Для постановки реакции диск-преципитации необходимы следующие компоненты:

1) преципитирующая сибиреязвенная сыворотка;

2) очищенный 1%-ный агаровый гель;

3) жидкая питательная среда для возбудителя сибирской язвы.

Техника проведения реакции диск-преципитации сводится к следующему. Преципитирующую сибиреязвенную сыворотку разливают по 0,5-1 мл в стерильные бактериологические пробирки. На поверхность сыворотки наслаивают расплавленный и охлажденный до 15°С 1%-ный агаровый гель столбиком высотой 5-7 мм. На поверхность застывшего агара вносят 1-1,5 мл жидкой питательной среды. При исследовании патологического материала и мяса вынужденно убитых животных посев производят в мясопептонный бульон.

Посевы выдерживают в термостате при 37° в течение 16-20 ч.

Учет результатов проводят визуально на темном фоне.

Возбудитель сибирской язвы образует в средней части столбика агарового геля тонкую с четкими границами белую линию (диск) преципитации.

Почвенные сибиреязвенные сапрофитные бациллы, за исключением нескольких штаммов Вас. anthracoides, дают отрицательный результат (диск преципитации отсутствует).

В качестве контроля при постановке реакции могут быть использованы посевы из противосибиреязвенной вакцины СТИ.

21.3. Реакция диффузионной преципитации (рдп)

Эта реакция нашла широкое применение при диагностике вирусных болезней, а также для определения титра преципитирующей сыворотки, для установления токсигенности некоторых видов микроорганизмов и др.

Техника проведения этой реакции сводится к следующему.

В стерильные чашки Петри разливают по 20-25 мл осветленного 1-1,5%-ного агара. После застывания агара в его слое делают лунки диаметром 5-6 мм в центре и на периферии на расстоянии 4-5 мм друг от друга. В каждую лунку вносят по одной капле агара для формирования дна лунки. Розлив компонентов реакции в лунки проводится различно в зависимости от поставленных целей.

Через 48 часов (24 часа инкубирования в термостате, 24 часа при комнатной температуре) проводится учет результатов реакции. За это время реагенты диффундируют в агар навстречу друг другу. При положительной реакции в месте встречи образуются полосы (дуги) – линии преципитации серо-белого цвета (рис. 62).

Рис. 62. Реакция диффузионной преципитации в агаровом геле

Эта реакция может быть осуществлена и микрометодом. В этом случае на предметных стеклах приготавливают слой агара, в котором делают лунки. В остальном эта реакция сходна с макрометодом.

Задания для самостоятельной работы

1. Провести постановку и учет результатов реакции кольцепреципитации методами «наслаивания» и «подслаивания».

2. Ознакомиться с результатами реакции диффузионной преципитации.

Вопросы дли самоподготовки и контроля знаний

1. Как называются компоненты в реакции преципитации?

1. Антитела.

2. Антиген.

3. Осадок, продукт соединения антигена с антителом.

А. Преципитат.

Б. Преципитиноген.

В.Преципитины.

2. Для постановки реакции преципитации используют метод наслаивания. Какова последовательность розлива компонентов при проведении реакции этим методом?

А. Антиген (экстракт), преципитирующая сыворотка.

Б. Преципитирующая сыворотка, антиген (экстракт).

3. Для постановки реакции преципитации используют метод подслаивания. Какова последовательность розлива компонентов при проведении реакции этим методом?

А. Антиген (экстракт), преципитирующая сыворотка.

Б. Преципитирующая сыворотка, антиген (экстракт).

4. Какие изменения претерпевает антиген под действием специфических антител в реакции преципитации?

А. Выпадает в осадок на границе обеих жидкостей.

Б. Склеивается.

В. Растворяется.

5. При постановке реакции преципитации проведен контроль: преципитирующая сыворотка и специфический антиген. Каков будет результат в этом контроле?

А. Отрицательный.

Б. Сомнительный.

В. Положительный.

6. При постановке реакции преципитации проведен контроль: нормальная сыворотка крови и специфический антиген. Каков будет результат в этом контроле?