Файл: Practicum_po_microbiologii.doc

В состав естественных сред входят компоненты растительного и животного происхождения: овощные, фруктовые соки, молоко, кровь, экстракты из мяса и т.д. Широко применяются из этой группы среды – мясо-пептонный бульон (МПБ), мясо-пептонный агар (МПА).

Синтетическими называют среды, в состав которых входят определенные химические соединения, растворенные в дистиллированной воде. В настоящее время микробиологи располагают синтетическими средами, не уступающими по своему составу натуральным.

По назначению питательные среды разделяются на обычные (простые), специальные, дифференциально-диагностические, элективные (избирательные).

К обычным средам относятся мясо-пептонный бульон и агар, на них растут многие виды микроорганизмов.

При отсутствии роста микробов на простых средах применяются специальные среды, в состав которых входят углеводы, сыворотка крови, кровь, асцит и др.

Дифференциально-диагностические среды позволяют достаточно быстро отличить одну группу бактерий от другой. К ним относятся среды для изучения сахаролитических, протеолитических свойств и др.

Элективные среды обеспечивают преимущественное развитие одного вида или группы микроорганизмов и менее пригодны или далее совсем не пригодны для развития других. В состав этих сред входят химические компоненты, которые задерживают развитие определенных групп микроорганизмов (желчь, краски, антибиотики, азид натрия и др.).

По физическому составу различают жидкие, полужидкие, плотные, сухие среды. Жидкие применяются для выяснения физиолого-биохимических особенностей микроорганизмов, для накопления биомассы или продуктов обмена; плотные - для выделения чистых культур (получение изолированных колоний), для хранения культур, количественного учета микроорганизмов и т.д.

6. 2. Приготовление питательных сред

Обычные питательные среды

К ним относятся мясо-пептонный бульон (МПБ) и мясо-пептонный агар (МПА). Основой для приготовления этих сред служит мясной экстракт. Для его приготовления берут 500 г свежей говядины или телятины, освобожденной от костей, жира и сухожилий, пропускают через мясорубку, фарш заливают 1 литром водопроводной воды, хорошо размешивают. Оставляют на сутки в прохладном месте или помещают на 2 часа в термостат при 37°. Мясной экстракт отжимают через марлю. Кипятят в течение 20 минут для свертывания белков, дают остыть. Фильтруют через ватный фильтр, доливают водой до первоначального объема. Приготовленный мясной экстракт разливают по флаконам и 20-30 минут стерилизуют в автоклаве. Правильно приготовленный мясной экстракт представляет собой слабокислую (рН=6,2) прозрачную желтоватую жидкость без белков. В ней содержится большое количество аминокислот, солей, углеводов, факторов роста и экстрактивных веществ.

Мясо-пептонный бульон (МПБ) – жидкая питательная среда, прозрачная. В 1 л мясного экстракта растворяют при подогревании и помешивании 10 г пептона (1 %) и 5 г (0,5 %) поваренной соли. Устанавливают рН среды 7,6. Кипятят 30-45 минут для выпадения осадка. Охлаждают, фильтруют через бумажный фильтр, заливают водой до первоначального объема, проверяют рН. Разливают по пробиркам, флаконам и стерилизуют 15-20 мин в автоклаве при давлении 1 атм.

Пептон представляет собой первичные продукты гидролизата белка. Он состоит из смеси альбумоз, полипептидов и аминокислот, полученных путем пепсинно-трипсинного гидролиза. На мясокомбинатах для производства сухого пептона используют фибрин, кровь и другие отходы. Сушат пептон в распылительной вакуум-сушилке.

Мясо-пептонный агар (МПА) – плотная питательная среда. Для его приготовления к мясо-пептонному бульону добавляют 2-3 % агар-агара, расплавляют в водяной бане, фильтруют, разливают по колбам или пробиркам и стерилизуют в автоклаве при давлении 1 атм 15-20 минут.

Для приготовления «скошенного» МПА среда, разлитая до ¼ высоты пробирки, вновь расплавляется и помещается на наклонную плоскость.

Для уплотнения сред чаще всего используют агар-агар, который представляет собой полисахарид, получаемый из красных морских водорослей. Большинство микроорганизмов не используют его в качестве питательного субстрата. В воде агар образует гели, плавящиеся при 100°, а затвердевающие при 40°.

Мясо-пептонный желатин (МПЖ) – к мясо-пептонному бульону добавляют 10-15 % мелко нарезанного желатина, после набухания его нагревают до полного расплавления. Устанавливают рН 7,0-7,1 и стерилизуют текучим паром 3 дня подряд по 30 мин. Для обнаружения протеолитических свойств культуру бактерий сеют уколом в столбик желатина, посевы оставляют на несколько дней при комнатной температуре для учета характера разжижения.

Желатин представляет собой белок, который получают путем выварки костей, хрящей и др.

Специальные среды

Сахарный МПБ и МПА. К обычным средам добавляют 1-2% глюкозы, разливают по пробиркам и стерилизуют текучим паром дробно или авто-клавируют при 0,5 атм 20 минут.

Сывороточный МПБ и МПА. К МПБ добавляют 5-10% стерильной сыворотки крови и разливают по пробиркам.

МПА расплавляют, остужают до 45-50° и добавляют 5-10% сыворотки крови. Полученную среду разливают в чашки Петри или пробирки.

Свернутая сыворотка. Сыворотку разливают по пробиркам (4-5 мл) и в наклонном положении свертывают в аппарате Коха (рис. 13). Свертывание проводят при 80° в течение полутора часов. Среду контролируют на стерильность в термостате в течение суток.

Кровяной МПА. К стерильному расплавленному и охлажденному до 45° МПА, разлитому в пробирки или чашки Петри, стерильно прибавляют 5-10% дефибринированной крови (кролика, барана).

Дифференциально-диагностические среды

Жидкие среды Гисса. Для их приготовления используется 1%-ная пептонная вода (рН=7,0) с 0,5 % соответствующего углевода и индикатора (бромтимолблау, Андредэ и др.). Улавливание газа производится путем помещения на дно пробирки поплавков (стеклянных трубок), запаянных с одного (верхнего) конца.

Для улавливания пузырьков газа можно также к жидкой среде Гисса добавить 0,5 % агар-агара.

Рис. 13. Аппарат Коха

Стерилизуют среды Гисса при 110° в течение 10 минут или текучим паром в течение 30 минут 3 дня подряд.

В настоящее время среды с углеводами выпускают в сухом виде фабричным способом. Они состоят из питательного агара, соответствующего углевода и индикатора ВР (смесь водного голубого красителя с розоловой кислотой). Для приготовления полужидкой среды 2 г сухой среды растворяют при подогревании в 100 мл дистиллированной воды и доводят до кипения, разливают в стерильные пробирки и стерилизуют 10 минут при 110° или дробно. Среда имеет цвет питательного агара.

При ферментации углеводов с образованием кислоты наблюдается посинение среды, с образованием щелочи – покраснение.

Для выделения чистой культуры возбудителей кишечных болезней и их дифференциации с Е. coli длительное время использовались среды Эндо и Левина, в настоящее время применяется главным образом среда Плоскирева.

Среда Эндо, выпускаемая в сухом виде, готовится следующим образом: 5 г порошка растворяют при подогревании в 100 мл дистиллированной воды, кипятят 2-3 минуты при постоянном помешивании и разливают в чашки.

При отсутствии сухой среды Эндо она может быть приготовлена ех tempore. К 100 мл стерильного расплавленного МПА добавляют 1 г лактозы, растворенной и прокипяченной в 5 мл дистиллированной воды, и 1 мл насыщенного спиртового раствора основного фуксина, обесцвеченного перед добавлением к агару 10%-ным водным раствором сульфита натрия до бледно-розового оттенка. Среду смешивают, разливают по чашкам и подсушивают в термостате.

Е. coli ферментирует лактозу с образованием кислоты. Обесцвеченный фуксин в среде Эндо с изменением реакции в кислую сторону приобретает первоначальный цвет, что и обусловливает красный с металлическим блеском цвет колоний Е. coli. Патогенные бактерии – возбудители кишечных болезней – не ферментируют лактозу и растут на среде Эндо в виде бесцветных колоний.

Среда Левина. Сухая среда Левина готовится аналогично сухой среде Эндо. При необходимости она может быть приготовлена ех tempore. К 100 мл стерильного расплавленного питательного агара добавляют 2 г лактозы, растворенной и прокипяченной в небольшом количестве дистиллированной воды, 2 мл 0,5%-ного предварительно прогретого водного раствора метиленовой сини и 1,5 мл 1%-ного водного раствора эозина (растворы красителей готовят заранее, стерилизуют текучим паром), 0,2 г двухосновного фосфорнокислого калия (К₂НРО₄), среду перемешивают и разливают по чашкам. Среда темно-лилового цвета. Колонии Е. соli имеют сине-черный цвет, бактерии, не ферментирующие лактозу, образуют бесцветные колонии. Данная среда, как и среда Эндо, используется в настоящее время главным образом для выделения Е. соli.

Среда Плоскирева содержит сухой питательный агар, набор различных солей, соли желчных кислот, бриллиантовую зелень и нейтральный красный индикатор. Е. соli в связи с подавлением ее жизнедеятельности солями желчных кислот и бриллиантовой зеленью, растут на этой среде скудно, в виде колоний розового цвета. Микробы из воздуха не растут (чашки в открытом виде подсушивают на воздухе в течение 1 часа). Патогенные бактерии сальмонеллы образуют на среде бесцветные прозрачные колонии.

Элективные среды

Среда Сент-Иваньи, в состав которой входит МПА с 0,1 % кристаллвиолета и 1 % азида натрия. На этой среде вырастает только возбудитель рожи свиней.

Для выделения чистой культуры гриба рода кандида применяют среду, содержащую МПА со стрептомицином.

Сухие питательные среды

В последние годы в бактериологии широко используются сухие питательные среды, что позволяет лабораториям избавиться от громоздкого процесса приготовления сред.

Для этого навеску, указанную на этикетке, всыпают в емкость с холодной дистиллированной водой и нагревают до кипения до полного растворения порошка.

Выпускают обычные, специальные, дифференциально-диагностические и элективные сухие среды.

Часто приходится разливать питательные среды мерно. С этой целью в лабораторной практике используют специальные приспособления (рис. 14).

Определение рН питательных сред производится электрометрическим методом – потенциометром (рис. 15). После установления рН питательной среды (МПБ обычно имеет рН 6,6-6,8) доводят его до нужного (рН 7,4). Для этого по каплям микропипеткой добавляют 0,1 н. едкий натр в стакан с питательной средой, в который опущены электроды потенциометра. После установления количества щелочи, необходимой для получения 7,4 на 1 мл среды делают расчет на нужное количество. Если на 1 мл затрачено 0,08 мл 0,1 н. раствора едкого натра, то к 10 литрам среды необходимо добавить 800 мл щелочи.

Во избежание разбавления питательной среды для получения необходимого рН к ней добавляют 1 н. раствор едкого натра, т.е. всего 80 мл.

Для определения рН плотных питательных сред расплавленный агар или желатин, учитывая буферность этих сред, разводят в 7 раз теплой дистиллированной водой. После установления соответствующего рН среду кипятят, фильтруют, осветляют, разливают во флаконы, пробирки и стерилизуют. Следует учитывать, что после стерилизации среда становится более кислой на 0,2 единицы.

Задания для самостоятельной работы

1. Ознакомиться с классификацией питательных сред, с основными принципами их приготовления.

2. Приготовить простые питательные среды – МПБ и МПА.

3. Определить и установить нужный рН в этих средах.

4. Питательные среды разлить по колбам, пробиркам и подготовить их к стерилизации.