Файл: Practicum_po_microbiologii.doc

А. Отрицательный.

Б. Сомнительный.

В. Положительный.

Тема 22. Реакция агглютинации: пробирочный метод (22.1). Другие модификации постановки реакции (22.2)

ЦЕЛЬ ЗАНЯТИЯ. Дать представление о сущности реакции агглютинации, применение ее в ветеринарно-лабораторной практике, получении и подготовке компонентов: освоить методы постановки реакции объемным (пробирочным) и капельным методами.

Ознакомить с различными модификациями проведения реакции агглютинации.

МАТЕРИАЛЬНОЕ ОСНАЩЕНИЕ. Пробирки агглютинационные в штативе, пипетки на 1 и 5 мл, резиновые груши, физиологический раствор в колбах, бруцеллезная (позитивная) и нормальная (негативная) сыворотки, единый бруцеллезный антиген для РА и РСК.

Предметные стекла, глазные пипетки, сальмонеллезный антиген и специфически сыворотки.

Для демонстрации: аппарат Флоринского, пробирки с положительной и отрицательной кольцевой реакцией с молоком на бруцеллез; плестиглазовые панели с гемагглютинацией; Роз-бенгаловая проба (РБП) на бруцеллез.

Агглютинацией называется склеивание микробных или других клеток при воздействии на них специфических антител в присутствии электролитов. Двухфазный характер этого взаимодействия ничем не отличается от механизма других двухкомпонентных реакций иммунитета: первая фаза – соединение бактерий с антителом; вторая – соединение бактерий под влиянием солевого раствора. Антиген, вступающий в реакцию, носит название агглютиногена, антитела сыворотки – агглютинины, а комплекс антигена + антитело, выпадающий при положительной реакции – агглютинат.

Реакция агглютинации используется для серологической диагностики многих инфекционных болезней, в том числе бруцеллеза, сальмонеллеза, колибактериоза, сапа, листериоза, кампилобактериоза и др.

Она проводится с двумя целями для:

а) обнаружения специфических антител в исследуемых сыворотках;

б) установления вида (серогруппы, сероварианта) выделенного микроорганизма (антигена) из патологического материала с использованием известных сывороток, содержащих специфические антитела.

Агглютинация происходит при температуре 37°С в слабощелочной солевой среде.

Различают следующие виды по характеру агглютинации:

1. Соматическую, когда происходит склеивание и оседание неподвижных, не имеющих жгутиков, микробов. Эта форма О-агглютинации протекает медленно, в течение 18-24 ч и дает плотный мелкозернистый осадок, который при встряхивании разбивается на мелкие зерна.

2. Жгутиковую, когда происходит склеивание и оседание подвижных, имеющих жгутики, микробов. Эта форма Н-агглютинации происходит значительно быстрее, уже через 2-4 ч, и дает рыхлый осадок, который при встряхивании легко разбивается на крупные хлопья.

Существует много вариантов постановки реакции агглютинации. Наиболее распространенными методами являются: развернутая реакция агглютинации, которая проводится в пробирках с различными разведениями сыворотки; на предметных стеклах (капельная, пластинчатая: кровяно-капельная гемагглютинация; кольцевая проба (реакция) с молоком, Роз-бенгалевая проба (РБП) и др.).

Компонентами для постановки реакции агглютинации с исследуемыми сыворотками являются:

1. Исследуемая сыворотка крови.

Кровь у животных берут из яремной вены (у свиней из ушной или хвостовой, у лисиц и песцов – из бедренной вены, у норок – путем отсечения подушечки среднего пальца задней лапы или кончика хвоста) в стерильные пробирки по 5-7 мл (от пушных зверей по 1-2 мл). Пробирки нумеруют и составляют опись проб.

Сыворотки крови получают методом отстоя. Для свертывания крови и отстаивания сыворотки пробирки с кровью выдерживают 30-60 мин при 20-30°С, сгусток крови от стенок отделяют стальной спицей, а затем пробы выдерживают при +4-10°С. Через 20-24 ч отстоявшуюся сыворотку сливают в сухие стерильные пробирки и направляют на исследование в лабораторию в свежем или консервированном виде.

Сыворотки консервируют:

- добавлением 0,05 мл (1 капля) 5%-ного раствора карболовой кислоты на каждый миллилитр сыворотки при постоянном перемешивании;

- сухой борной кислотой (2-4 % к объему сыворотки) до получения насыщенного раствора и образования на дне пробирки небольшого осадка кристаллов.

Неконсервированные сыворотки пригодны для исследования в течение 6 дней со дня взятия крови с сохранением их при +4-8 °С. Сыворотки, консервированные карболовой или борной кислотой, пригодны для исследования в течение 30 дней. Мутные, проросшие, гемолизированные сыворотки крови исследованию не подлежат.

В зависимости от вида диагностируемой болезни для проведения реакции агглютинации исследуемые сыворотки разводят физиологическим раствором согласно наставлению.

2. Известный антиген представляет из себя взвесь убитых, реже живых бактерий в физиологическом растворе в определенной концентрации. Антигены изготовляют и стандартизируют на биопредприятиях.

3. Физиологический раствор, который представляет из себя 0,85%-ный раствор поваренной соли.

Для контроля РА используют компоненты:

1. Позитивная (положительная) сыворотка, изготовленная биопредприятием или полученная от больного животного.

2. Негативная (отрицательная) – сыворотка крови здоровых животных, изготовленная биопредприятием или полученная в лаборатории.

Компонентами для постановки реакции агглютинации для определения вида микроба с использованием известных специфических сывороток являются:

1. Диагностические агглютинирующие сыворотки, которые получают путем гипериммунизации кроликов, реже – других животных. Им вводят подкожно 5-7 раз, а затем внутривенно в возрастающих количествах взвесь убитых, а последние три инъекции — живых микробов.

Интервалы между инъекциями колеблются от двух до пяти-семи дней. Через неделю после окончания иммунизации производят пробное взятие крови и ставят реакцию агглютинации для определения титра сыворотки. Если титр антител в сыворотке крови недостаточно велик, иммунизацию продолжают. При наличии высокого титра производят массивное взятие крови или полное обескровливание животного с целью получения сыворотки.

Диагностические наборы для проведения реакции агглютинации выпускаются биопредприятиями.

2. Исследуемый антиген, в качестве последнего используют взвесь микробов. Для этого суточную или 20-часовую изучаемую культуру на скошенном МПА смывают 5 мл 0,85%-ного раствора хлористого натрия и переносят в чистую пробирку.

При постановке капельным методом антигеном служит микробная культура.

3. Физиологический раствор поваренной соли.

22.1. Постановка реакции агглютинации классическим (пробирочным) методом

В качестве примера приводим постановку РА на бруцеллез с сывороткой крови крупного рогатого скота.

Реакция ставится в объеме 1 мл жидкости. Разлив компонентов реакции проводят индивидуальными мерными пипетками; автоматическими пипетками Флоринского, одиночными (рис. 63) или групповыми (рис. 64).

Для исследования каждой испытуемой сыворотки крови требуется 5 пробирок, поставленных в первый ряд. Количество таких рядов зависит от числа исследуемых сывороток. В первой пробирке каждого ряда готовят основное разведение 1:25. Для этого к 2,4 мл физиологического раствора вносят 0,1 мл исследуемой сыворотки. После приготовления основного разведения сывороток в остальные 4 пробирки, кроме 2-й, каждого ряда разливают по 0,5 мл физиологического раствора. Затем из первой пробирки из разведения 1:25 вносят 0,5 мл во вторую пробирку, получая разведение 1:50. Из этого разведения готовят разведение 1:100, перенося из одной пробирки 0,5 мл жидкости. Методом последовательного разведения готовят разведение 1:200 и 1: 400. Из последней пробирки (1:400) излишек жидкости 0,5 мл удаляют (рис. 65).

Рис. 63. Одиночная автоматическая пипетка Флоринского: а - стеклянный патрубок; б - расширение для сбора избыточной жидкости; в - резиновая груша; г — пипетка-мерник

Рис. 64. Групповая автоматическая пипетка Флоринского: а - стеклянный цилиндр; б - отверстие в нижней части цилиндра; в - пипетки-мерники; г - приемник для избыточной жидкости; д — отверстие для слива избыточной жидкости; е -резиновая груша

Во все пробирки, кроме первой, вносят по 0,5 мл антигена, разведенного 1:10

Рис. 65. Схема постановки реакции агглютинации пробирочным методом

Таким образом получают ряд из четырех исследуемых пробирок с разведениями сыворотки 1:50, 1:100, 1:200, 1:400 в объеме 0,5 мл.

Во все пробирки каждого ряда, кроме первой (1:25), вносят по 0,5 мл антигена, предварительно разбавленного 1:10 физиологическим раствором. Первая пробирка с сывороткой в разведении 1:25 без антигена служит контролем качества сыворотки. При наличии хлопьев, фибрина, эритроцитов и посторонних примесей результаты агглютинации не учитываются.