Файл: Practicum_po_microbiologii.doc

Тема 5. Сложные (дифференциальные) методы окрашивания бактерий: окраска спор (5.1) и капсул (5.2)

ЦЕЛЬ ЗАНЯТИЯ. Овладеть методикой окраски спор и капсул у бактерий.

МАТЕРИАЛЬНОЕ ОСНАЩЕНИЕ. Комплект оборудования для окраски мазков. Набор красок и реактивов для окраски спор и капсул. Пробирки со взвесью вакцинного штамма возбудителя сибирской язвы для окраски спор; готовые препараты из патматериала белой мыши, погибшей от возбудителя сибирской язвы (II вакцина Ценковского), окрашенные на капсулы методами по Ольту, по Михину, по Романовскому-Гимзе.

5.1. Окраска спор

Некоторые виды патогенных бактерий способны к образованию устойчивой формы, которая получила название – спора (рис. 11). К спорообразованию способны возбудители сибирской язвы, столбняка, ботулизма и др., а также многие почвенные сапрофиты.

Рис. 11. Локализация спор в бактериальной клетке: 1 - бацилл; 2 - клостридий

В отличие от вегетативных клеток споры устойчивы к кипячению в воде, действию дезинфицирующих веществ, к высушиванию и другим факторам. Все это дает возможность спорообразующим микроорганизмам длительное время сохраняться во внешней среде – в воде, в почве, в навозе и т.д.

Возбудитель сибирской язвы в виде спор в почве может сохраняться десятилетиями. В связи с этим сибиреязвенные трупы обязательно сжигают.

К окраске спор в лабораторной практике прибегают сравнительно редко. Обычно ограничиваются обнаружением непрокрашиваемых округлых или овальных образований внутри бактериальных клеток при окраске простым методом или по Граму.

Метод Златогорова

1. Фиксированный препарат окрашивают карболовым фуксином при подогревании до 10 мин.

2. Обесцвечивают 2%-ным раствором серной кислоты 3-5 с.

3. Промывают водой.

4. Дополнительно окрашивают метиленовой синью 4-5 мин.

Микрокартина: споры - красные, вегетативные клетки - синие.

Метод Пешкова

1. Фиксированный препарат окрашивают метиленовой синью при подогревании 3 мин.

2. Окрашивают 1%-ным водным раствором нейтрольрот 10 с.

Микрокартина: споры - синие, вегетативные клетки - красные.

Обнаружение спор у микробов является видовым признаком.

5.2. Окраска капсул

Некоторые виды патогенных бактерий в инфицированном организме способны образовывать вокруг себя слизистый слой, который называют капсулой (рис. 12). Капсулу образуют возбудители сибирской язвы, диплококковой септицемии и др.

Физиологическое значение капсулы у патогенных микробов определяют как защиту от влияния факторов иммунитета организма. Обнаружение капсулы у бактерии является видовым признаком, Особое значение это имеет при бактериологической диагностике сибирской язвы – по результатам такого исследования немедленно дают предварительный ответ.

Метод Михина

1. Фиксированный мазок-отпечаток, приготовленный из патматериала, окрашивают метиленовой синью при подогревании до 7 мин.

2. Промывают водой.

Микрокартина: капсула – бледно-розовая, бактерии – синие.

Рис. 12. Капсула у бактерий: а – бацилла сибирской язвы; б – диплококк

Метод Олъта

1. Фиксированный мазок-отпечаток, приготовленный из патматериала, окрашивают 2%-ным раствором сафранина при легком подогревании 5-7 мин.

2. Слегка промывают водой.

Микрокартина: капсула – желтая, бактерии – красные.

Микрокартину зарисовать.

Метод Романовского-Гимзе

1. Фиксированный мазок-отпечаток помещают мазком вниз в чашку Петри, на дне которой устанавливают подставки (спички). Под препарат наливают краску Гимзе. Краску предварительно разводят дистиллированной водой 1:10.

2. Окрашивают разведенной краской Гимзе 50-60 мин.

3. Промывают водой.

Микрокартина: капсула – бледно-розовая, бактерии – синие.

Обнаружение капсул у микробов является видовым признаком.

Вопросы для самоподготовки и контроля знаний

1. Споры у бактерий служат для:

А. Размножения.

Б. Сохранения вида в неблагоприятных условиях.

В. Передвижения.

Г. Адгезии.

2. Выберите правильную последовательность красок и реактивов, необходимых для окраски спор по методу Златогорова:

А. Метиленовая синь, обесцвечивание раствором серной кислоты, промывание водой, карболовый фуксин с подогреванием.

Б. Карболовый фуксин с подогреванием, промывание водой, обесцвечивание раствором серной кислоты, метиленовая синь.

В. Карболовый фуксин с подогреванием, обесцвечивание раствором серной кислоты, промывание водой, метиленовая синь.

Г. Метиленовая синь с подогреванием, обесцвечивание раствором серной кислоты, промывание водой, карболовый фуксин.

3. При микроскопии препарата, приготовленного из споровой культуры сенной палочки и окрашенного по методу Златогорова, обнаружено: вегетативные клетки окрашены в синий цвет, споры бесцветные. Найти вероятную ошибку, которая была допущена при окраске препарата:

А. Кратковременная окраска метиленовой синью.

Б. Кратковременное обесцвечивание раствором серной кислоты.

В. Длительное обесцвечивание раствором серной кислоты.

Г. Длительная окраска карболовым фуксином.

4. К спорообразующим микроорганизмам относятся возбудители:

А. Колибактериоза.

Б. Сибирской язвы.

В. Столбняка.

Г. Ботулизма.

Д. Рожи свиней.

5. Макрокапсула у патогенных бактерий служит для:

А. Защиты от фагоцитоза.

Б. Сохранения наследственной информации.

В. Защиты от бактерицидных факторов крови.

Г. Адгезии.

6. Для выявления капсулы у бактерий используют методы окраски:

А. По Граму.

Б. По Златогорову.

В. По Пешкову.

Г. По Михину.

7. Определите правильность тинкториальных признаков у капсулообразующего микроба возбудителя сибирской язвы, окрашенного по методу Ольта (препарат приготовлен из крови животного, павшего от сибирской язвы):

А. Капсула – желтого, вегетативная клетка – кирпично-красного цвета.

Б. Капсула кирпично-красного цвета, вегетативная клетка – желтого цвета.

В. Капсула розового, вегетативная клетка кирпично-красного цвета.

8. Бактерии, имеющие макрокапсулу (капсулообразующие):

А. Кишечная палочка.

Б. Сибиреязвенная палочка.

В. Возбудитель диплококковой септицемии.

Г. Возбудитель туляремии.

Б. БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Этот этап предусматривает выполнение работ в следующей последовательности:

- приготовление питательных сред;

- определение и установление в них оптимальной концентрации водородных ионов (рН);

- выбор метода стерилизации питательных сред и ее проведение;

- выделение чистых культур бактерий (посевы и пересевы, методы культивирования):

- изучение культуральных свойств бактерий на жидких и плотных питательных средах;

- изучение биохимических (ферментативных) свойств бактерий (сахаролитических, протеолитических, гемолитических и др.);

- исследование бактерий на подвижность в препаратах «висячая» или «раздавленная» капля, приготовленных из чистых культур выделенных бактерий;

- определение чувствительности бактерий к антибиотикам.

Тема 6. Назначение и классификация питательных сред для бактерий (6.1) и их приготовление (6.2)

ЦЕЛЬ ЗАНЯТИЯ. Дать представление о назначении питательных сред и их классификации. Ознакомить с методами приготовления питательных сред. Освоить методы определения рН питательных сред.

МАТЕРИАЛЬНОЕ ОСНАЩЕНИЕ. Компоненты для приготовления питательных сред: мясная вода, пептон, поваренная соль, агар-агар, желатин, воронки, колбы, марля, вата, пипетки, дистиллированная вода, пробирки с ватными пробками. Набор готовых питательных сред. Оборудование для определения рН – потенциометр, готовый МПБ, 0,1 н. и 10%-ный раствор едкого натра. Таблицы, схемы.

6.1. Назначение и классификация питательных сред

Бактериологические исследования связаны с использованием питательных сред, которые предназначены для выращивания микроорганизмов как в лабораториях, так и в промышленных условиях.

Питательные среды необходимы для выделения, накопления, сохранения, изучения культуральных и биохимических свойств микроорганизмов. Они должны включать в себя все компоненты, необходимые для конструктивных и энергетических процессов бактериальной клетки, т.е. должны иметь источники углерода, азота, кислорода, водорода, макро- и микроэлементы, «факторы роста» (витамины).

Метаболизм микроорганизмов разнообразен, следовательно, различны их потребности в источниках питания. Отсюда следует, что универсальных питательных сред, одинаково пригодных для культивирования всех видов микроорганизмов, не существует.

Вместе с тем можно сформулировать следующие требования, предъявляемые к питательным средам:

- питательные среды должны содержать все питательные вещества, обеспечивающие оптимальный рост микроорганизмов в искусственных условиях;

- в физико-химическом отношении они должны иметь определенную концентрацию водородных ионов (рН), окислительно-иосстановительный потенциал, влажность, вязкость и изотоничность;

- питательные среды должны быть стерильными и, по возможности, прозрачными.

По составу среды для культивирования микроорганизмов делятся на две группы: натуральные (естественные) и синтетические (табл. 1).

Таблица 1

Классификация питательных сред