Файл: Practicum_po_microbiologii.doc

При постановке РА одновременно с исследуемыми сыворотками ставят контроля:

- с негативной (отрицательной) сывороткой в тех разведениях, как с исследуемыми;

- с позитивной (положительной) сывороткой в разведениях до ее предельного титра;

- контроль антигена (0,5 мл физиологического раствора с 0,5 мл разведенного антигена) для исключения спонтанной агглютинации.

После розлива всех компонентов штативы с пробирками осторожно стряхивают и помещают в термостат при 37-38°С на 16-20 ч, затем выдерживают при комнатной температуре в течение 1 ч и проводят учет реакции.

Результаты реакции учитывают визуально и определяют ее степень в плюсах по следующей схеме (рис. 66).

Рис. 66. Реакция агглютинации при постановке пробирочным методом: 1 и 2 отрицательные; 3 и 4 - положительные

(++++) – полное просветление жидкости, на дне осадок в виде «зонтика», при легком встряхивании осадок разбивается на мелкие зерна, а жидкость остается прозрачной (100%-ная агглютинация);

(+++) – неполное просветление жидкости, «зонтик» хорошо выражен, при встряхивании – мелкие зерна (75%-ная агглютинация);

(++) – незначительное просветление жидкости, «зонтик» умеренно выражен, при встряхивании мелкие зерна (50%-ная агглютинация);

(+) – едва заметное просветление жидкости, «зонтик» выражен слабо, при встряхивании заметно небольшое количество зерен (25%-ная агглютинация);

(–) – просветление жидкости, образования «зонтика» не наступило, на дне пробирки видна «пуговка» осевших микробов, при легком встряхивании образуется равномерная взвесь.

За титр антител принимают последнее разведение сыворотки, в котором произошла агглютинация не менее чем на два плюса (++).

Реакцию считают положительной при наличии агглютинации с сывороткой крупного рогатого скота с оценкой не менее чем два плюса (++) в разведении 1:100 и выше.

Реакцию считают сомнительной при наличии агглютинации только в разведении 1:50 с сыворотками крупного рогатого скота с оценкой не менее чем на два (++).

Для определения природы антител в исследуемом материале предложено несколько модификаций проведения реакции агглютинации.

22.2. Другие модификации постановки реакции. Кольцевая реакция с молоком (кр)

Применяется КР с целью проверки благополучия стад на бруцеллез крупного рогатого скота и для проверки молока при продаже его на рынках.

Компонентами реакции являются:

- исследуемое молоко;

- антиген цветной бруцеллезный для кольцевой реакции с молоком, который представляет собой стандартизованную взвесь убитых бруцелл, окрашенных гематоксилином в синий цвет;

- сыворотка позитивная бруцеллезная.

В агглютинационные пробирки берут по два мл молока и добавляют по 0,1 мл антигена, затем пробирки тщательно встряхивают для перемешивания молока с антигеном.

При каждой постановке реакции одновременно с испытуемыми пробами молока ставят контроли: с молоком от заведомо здоровой коровы; со смесью молока здоровой коровы и позитивной бруцеллезной сыворотки (0,05 мл сыворотки на 1 мл молока). Штативы с испытуемыми и контрольными пробами молока помещают в водяную баню или термостат при 37-38°С на 1 час. Если в молоке имеются бруцеллезные антитела, то они образуют с антигеном комплекс, который адсорбируется на капельках жира и при отстаивании всплывают вверх, образуя синее кольцо (остальная часть молока остается белой) – реакция положительная.

При отрицательной реакции столбик молока остается равномерно окрашенным в первоначальный синий цвет, который был получен сразу после добавления к нему антигена, а слой сливок – белого или слегка желтоватого цвета.

Рис. 67. Капельная реакция агглютинации на предметном стекле: а – положительная; б – отрицательная

При получении положительного или сомнительного результата КР от всех животных берут кровь для исследования на бруцеллез в РБП или РА и РСК (РДСК), проводят эпизоотологическое обследование хозяйства, клинический осмотр и исследование животных на заболевание маститами.

К а п е л ь н ы й м е т о д РА применяют в основном для идентификации культур бактерий, а также для установления их принадлежности к определенным серогруппам и серовариантам. Так поступают при диагностике колибактериоза и сальмонеллезов. Техника постановки РА сводится к следующему. На предметное стекло наносят каплю сыворотки и каплю физиологического раствора (контроль). Петлю с бактериальной культурой увлажняют в капле сыворотки, затем культуру тщательно растирают рядом с каплей, смешивают с сывороткой и энергично 6-10 раз покачивают стекло круговыми движениями. Агглютинация наступает сразу или не позднее 1-2 мин. Реакцию агглютинации учитывают при хорошем освещении. Пользование лупой облегчает учет реакции.

Агглютинация проявляется в виде склеивания бактериальной массы и полного или частичного просветления жидкости.

При отрицательной реакции культура после тщательного смешивания с каплей сыворотки образует гомогенную взвесь (рис. 67). То же самое должно быть при проведении контроля (антиген + физиологический раствор).

Р о з-б е н г а л п р о б а (РБП)

Пластинчатую реакцию агглютинации с бруцеллезным роз-бенгал антигеном применяют для исследования сывороток крови при диагностике бруцеллеза у многих видов животных.

Компонентами РБП являются:

- испытуемые сыворотки крови;

- бруцеллезный антиген для РБП, изготовляемый на биопредприятиях, представляет собой стандартизированную суспензию в буферном растворе инактивированных нагреванием и фенолом бруцелл, окрашенных бенгальским розовым в розовый цвет;

- позитивная бруцеллезная и негативная сыворотки;

- 0,5%-ный карболизированный физиологический раствор.

Реакцию проводят на чистых сухих эмалированных пластинках с лунками при температуре 18-30°С.

Исследуемые сыворотки крови в дозе 0,03 мл вносят на дно лунки. При исследовании сывороток крупного рогатого скота, лошадей, верблюдов, свиней в каждую лунку рядом с сывороткой вносят 0,03 мл антигена, а при исследовании сывороток других животных – 0,015 мл, тщательно смешивают покачиванием и легким вращением в течение 4 мин. Одновременно проводят контроли антигена с позитивной и негативной сыворотками, с физраствором.

Реакцию считают положительной при выраженной агглютинации окрашенных бруцелл в виде мелких или крупных хлопьев розового цвета, выделяющихся на белом фоне лунки. Реакцию считают отрицательной при отсутствии агглютинации (смесь гомогенна, равномерно окрашена).

Р е а к ц и я г е м а г г л ю т и н а ц и и (РГА)

Эта реакция не относится к реакциям иммунитета, так как является результатом действия естественных гемагглютининов некоторых бактерий и вирусов на эритроциты, что влечет за собой их агглютинацию.

Реакцию ставят на плексигласовых панелях с лунками.

Исследуемый материал разводят физраствором и к этим разведениям добавляют равный объем 1-2%-ной взвеси эритроцитов, после чего панели с реакцией помещают в термостат на 30 мин или оставляют при комнатной температуре на 1 ч.

Учет реакции производят по характеру осадка. При положительной реакции осадок из склеившихся эритроцитов имеет форму раскрытого «зонтика» с изрезанными краями, а при отрицательной — компактный диск в виде «кнопки» с ровными краями.

Реакция гемагглютинации позволяет только выявить гемагглю-тинирующую способность бактерий и вирусов.

Для идентификации этих микроорганизмов в дальнейшем используют реакцию торможения гемагглютинации.

Р е а к ц и я т о р м о ж е н и я г е м а г г л ю т и н а ц и и (РТГА)

РТГА – иммунная реакция, в которой специфические антитела, взаимодействуя с антигеном, лишают его способности агглютинировать эритроциты.

Реакция проводится в два этапа. На первом этапе разводят специфическую сыворотку от 1:10 до 1:1280, К каждому разведению сыворотки добавляют равный объем жидкости, содержащий антиген в четырехкратном титре, который определен в РГА. Если титр антигена равен 1:640, агглютинируют эритроциты, делают разведение в 4 раза концентрированнее – 1:160.

После инкубирования при 37°С в течение 30 мин на втором этапе к этой смеси добавляют равный объем 1-2%-ной взвеси эритроцитов. Если сыворотки и антигена взято по 0,25 мл, то эритроцитов добавляют 0,5 мл.

Контролем является проба, где сыворотка заменена физраствором. Реакция читается после выдерживания в течение 30 мин в термостате или 45 мин при комнатной температуре.

При положительной РТГА образуется плотный осадок эритроцитов (задержка реакции) на дне пробирки, имеющих вид «пуговки» диска.

При отрицательной РТГА отмечается выраженная гемагглютинация в виде «зонтика».

Реакция используется для идентификации и типизации выделенного антигена, титрования вируссодержащих жидкостей и материалов и серологическом диагностики вирусных инфекций.

Р е а к ц и я н е п р я м о й (п а с с и в н о й) г е м а г г л ю т и н а ц и и (Р Н Г А)

Сущность этой реакции заключается в том, что на поверхность эритроцитов адсорбируют или антиген, или антитела (иммуноглобулины), которые приобретают способность агглютинироваться в присутствии специфических антител или антигена.

Главными достоинствами РНГА – высокая чувствительность и специфичность, техническая простота, стабильность используемых компонентов.

РНГА применяют при диагностике инфекционных болезней:

1) для обнаружения в титрования антител в исследуемой сыворотке крови с помощью известного эритроцитарного антигенного диагностикума;

2) для идентификации неизвестного антигена с помощью известного иммуноглобулинного эритроцитарного диагностикума.

Учет РНГА проводится так же, как и при постановке РГА.

Задания для самостоятельной работы

1. Провести постановку и учет результатов реакции агглютинации капельным методом с неизвестным антигеном с использованием набора агглютинирующих сальмонеллезных сывороток.

2. Провести постановку реакции агглютинации классическим (пробирочным методом) на бруцеллез с сыворотками крови крупного рогатого скота (учет результатов провести на следующем занятии).

3. Ознакомиться с результатами кольцевой реакции с молоком на бруцеллез, с реакцией гемагглютинации с Роз-бенгаловой пробой на бруцеллез.

Вопросы для самоподготовки и контроля знаний

1. Как называются компоненты в реакции агглютинации?

1. Антитела.

2. Антиген.

3. Осадок, продукт соединения антигена с антителом.

А. Агглютинат.

Б. Агглютиноген.

В. Агглютинины.

2. Для постановки реакции агглютинации необходимо приготовить исходное разведение исследуемой сыворотки 1:25. Какой из приведенных вариантов удовлетворяет это условие?

А. 0,3 мл сыворотки + 4,7 мл физраствора.

Б. 0,2 мл сыворотки + 4,8 мл физраствора.

В. 0,1 мл сыворотки + 4,9 мл физраствора.

3. При чтении реакции агглютинации в одной из пробирок установлены следующие признаки – жидкость мутная (непрозрачная), на дне небольшой осадок. Дать оценку реакции агглютинации на плюсовой системе.

А. ++++

Б. +++

В. ++

Г. +

Д. –

4. При чтении реакции агглютинации на бруцеллез с сывороткой крупного рогатого скота получены результаты:

1:50 +++, 1:100 +++, 1:200 ++, 1:400 ++. Дайте оценку реакции.

А. Отрицательная.

Б. Сомнительная.

В. Положительная.

5. В лабораторию присланы пробы сыворотки крови крупного рогатого скота. Какие разведения сыворотки нужно приготовить для постановки реакции агглютинации на бруцеллез?

А. 1:50,1:100, 1:200, 1:400.

Б. 1:25, 1:50, 1:100, 1:200.

6. Какие изменения претерпевает антиген под действием специфических антител в реакции агглютинации?

А. Выпадает осадок на границе обеих жидкостей.

Б. Склеивается.

В. Растворяется.

7. При положительной реакции агглютинации в пробирке наблюдается осадок в виде «зонтика», при встряхивании которого образуются крупные хлопья. К какому виду агглютинации относится данная реакция?